沉积物和生物样品中持久性有机物的分析

中国环境学会 2011年 03月31日

　　
　　曲健1, 解天民2
　　1.沈阳市环境监测中心站沈阳 110016； 2.美国康涅狄格州政府实验室
　　（沈阳市沈河区文艺路42号联系电话13332402637）

　　摘要本文采用快速溶剂萃取法(ASE)同时提取沉积物和生物组织中的多环芳烃(PAHs)、有机氯农药(OCP)和多氯联苯(PCBs)，经硅胶、凝胶色谱法（GPC）、氟罗里硅土柱净化除干扰后，分别进行GC/MS和GC/ECD分析。本法采用选择离子监测（SIM），对24种多环芳烃进行了测定，检出限达到 2~4g/kg；采用气相色谱双柱双电子捕获检测器测定28种有机氯农药和20种多氯联苯单体，检出限达到0.1~2.2 g/kg。
　　关键词沉积物生物组织样品快速溶剂萃取法多环芳烃多氯联苯有机氯农药 GC/MS GC/ECD

　　多环芳烃、多氯联苯和有机氯农药都属于人类合成化学品，因其难降解性、“三致”性、生物富集性越来越引起人类的重视，多数化合物被确定为持久性有机物。了解这些化合物在环境中的分布情况，尤其是在沉积物和生物组织内的富集情况对保护人类健康有重要意义。
　　本文提供了同时从沉积物和生物组织提取多环芳烃、农药与多氯联苯的方法和测定方法，方法中采用快速溶剂萃取法，在一定温度和压力下用少量溶剂在较短的时间内提取目标化合物，利用多种净化方法有效除去样品中的各种干扰物质，用气相色谱质谱联机和双柱双电子捕获检测器气相色谱法分别对多环芳烃、农药和多氯联苯进行分析。前处理过程中加入了回收率指示物(替代标准物)，提高了方法的准确性。提取一次完成将大大缩短样品的分析时间。这对于样品量大，前处理步骤复杂的分析具有重要意义。

　　实验部分

　　仪器和材料
　　气相色谱－质谱联机附自动进样器，Agilent 6890N/5973N；气相色谱仪（单进样口、双柱双电子捕获检测器，Agilent 6890N；快速溶剂萃取仪（ASE 200），萃取室34毫升；凝胶渗透色谱仪，GPC AutoprepTM Model 1000，GPC柱，Phenomenex 00W-3035-PO，内径2.1厘米，长33厘米；有机样品浓缩仪，Labconco* RapidVap。
　　层析柱，内径2.5厘米，长30厘米，下具聚四氟乙烯活塞；硅胶：100-200目，用前于170℃烘24小时，使用时加入3.3％水去活；氟罗里硅土小柱，1g；干燥剂，硅藻土（ASE使用）。
　　二氯甲烷、丙酮、正己烷、无水硫酸钠，农残级；铜粉，使用前用浓盐酸浸泡5 min。
　　多环芳烃标准使用液，以二氯甲烷为溶剂，配制24种多环芳烃和2种回收率指示物混合标准系列依次为0.05 μg /mL、0.10 μg /mL、0.20 μg /mL、0.50 μg /mL、1.0 μg /mL、2.0 μg /mL，各取1.00 mL，加入5 µL内标1；有机氯农药和多氯联苯标准使用液，以正己烷为溶剂，配制25种有机氯农药、20种多氯联苯和2种回收率指示物混合标准系列依次为2.5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL，各取1.00 mL，加入5 µL内标2。多环芳烃回收率指示物溶液，对三联苯-d14和硝基苯-d5混合溶液，2µg/mL，溶剂丙酮；有机氯农药和多氯联苯回收率指示物溶液，八溴八氟联苯（DBOFB）和八氟萘（OCN）混合溶液，200 ng/mL，溶剂丙酮。多环芳烃内标（内标1），萘-d8，苊-d10，菲-d10，屈-d12，苝-d12，100μg /mL，溶剂二氯甲烷；有机氯农药和多氯联苯内标（内标2），1-溴-2-硝基苯，20μg/mL，溶剂正己烷。仪器校准溶液，十氟三苯基磷（DFTPP），50 ng/µL，溶剂二氯甲烷。多环芳烃掺入用标准工作溶液：所有多环芳烃目标化合物，2µg/mL，溶剂丙酮；农药及多氯联苯掺入用标准工作溶液：所有农药及多氯联苯目标化合物，200ng/mL，溶剂丙酮。

　　样品采集保存
　　采集的沉积物样品装于具聚四氟衬垫的广口玻璃瓶内，生物组织用锡纸包好冷冻带回实验室。生物组织样品用组织捣碎机捣碎后（<1mm)装于玻璃瓶中密封，于-20℃保存。样品提取液在4℃以下暗处保存。

　　样品的提取
　　样品放至室温，倾出表面水分，除去杂物后混匀。生物样品如果含水量很大（捣碎后显浆状）置于真空冻干机内冻干，计算含水量。称取5～10 g样品（脂肪组织样品样品量不宜大于1g）放于250 mL烧杯中，按照1：4的比例加入硅藻土，混合均匀。转移到快速溶剂萃取仪的样品池中，用少许二氯甲烷浸润表面，加入0.5 mL多环芳烃回收率指示物，0.5mL有机氯农药和多氯联苯回收率指示物，旋紧样品池盖，置于快速溶剂萃取仪，用二氯甲烷提取。
　　空白样品：称取等量的纯净砂，与样品完全一样进行制备。实验室空白加标样品：按空白样制备，加入0.5mL多环芳烃掺入用标准工作溶液及0.5mL农药及多氯联苯掺入用标准工作溶液；基质加标样品：按样品制备，但多加入0.5mL多环芳烃掺入用标准工作溶液及0.5mL农药及多氯联苯掺入用标准工作溶液。
　　ASE提取条件：压力1500Psi，温度60℃，加热时间5 min，静置时间3min，冲洗体积60%，吹扫时间180s，2个循环周期。

　　样品的净化与浓缩
　　1.4.1 硅胶柱净化
　　层析柱依次填入玻璃棉、2cm高度无水硫酸钠、15-20g硅胶和2cm高无水硫酸钠，测定沉积物再加入一定量铜粉。柱子装好后用50mL二氯甲烷冲洗2次，确保柱内液体不能流干，把样品提取液转移入柱内，再以5-10mL/min流速接收流出液，用5mL×3次二氯甲烷淋洗提取液瓶，转移到层析柱内；用二氯甲烷洗脱层析柱，接收流出液200mL左右。流出液转移至浓缩瓶中，浓缩并准确定容至10mL。
　　1.4.2 凝胶色谱（GPC）净化
　　用0.45µm滤膜过滤浓缩液，取5mL进行凝胶色谱净化，除去亲酯性大分子物质。收集馏分，继续浓缩并准确定容至1mL，分取0.5mL加入5.0µl内标1，混匀，作为多环芳烃的待测液。
　　1.4.3 氟罗里硅土（florisil）小柱净化
　　将上述另外0.5mL萃取液溶剂转换为正已烷，定容至1mL。用4mL正己烷淋洗1g氟罗里硅土小柱，让其在柱内停留5min后弃去，避免溶剂流干，将经过溶剂转化的溶液全部转移至小柱，以2mL/min流速接收流出液，用少许1：9丙酮/正己烷淋洗样品浓缩瓶三次，并转到小柱中，继续洗脱，接收洗脱液10mL左右。浓缩定容至0.5mL，加入5µl内标2，混匀，用于有机氯农药和多氯联苯的测定。

　　生物组织样品的总可萃取脂肪的含量（TEO）测定
　　将1.3的接收瓶的液面处做标记，准确移取4.00mL提取液于预先恒重的铝箔盘(m1)内，用铝箔纸盖在盘上，在通风橱内放置过夜，称重（m2）。瓶内液体全部转移后，测量标记处的体积V。

　　样品分析
　　1.6.1 仪器测试条件
　　1.6.1.1 测定多环芳烃的GC-MS条件
　　色谱柱：石英毛细管柱（Phenomen ZB-5）30m ×0.25mm（id）×0.5μm ；柱温：45℃保持2min，以10℃／min升至320℃，保持5.min；进样口温度：270℃；脉冲无分流进样，进样量1µl；氦气恒流，36cm/sec；传输线280℃，离子源230℃；电子轰击能量70ev；数据采集方式，选择离子监测（SIM）。
　　1.6.1.2 测定农药和多氯联苯的GC条件
　　色谱柱：石英毛细柱，DB-XLB和DB-5MS 60m ×0.25mm（id）×0.25μm ；柱温：90℃保持1min，以50℃／min升至210℃，保持5 min，以1℃／min升至235℃，以2℃／min升至245℃，以4℃／min升至320℃，保持2. min；单进样口，接预柱经Y型分流管连接两根色谱柱到双µECD检测器，进样口250℃，不分流进样2.0µl；氦气恒流27cm/s；检测器320℃，尾吹气25mL/min。
　　1.6.2 仪器的校准及检查
　　1.6.2.1 气相色谱质谱联机校准，仪器每运行12小时需注入50 ng的DFTPP溶液，所得质量丰度应满足表1的要求。
　　表1. DFTPP关键离子及离子丰度评价

离子质量数	相对丰度要求	离子质量数	相对丰度要求
51	基峰的30-60%	199	基峰的5-9%
68	小于69峰的2%	275	基峰的10-30%
70	小于69峰的2%	365	大于基峰的1%
127	基峰的40-60%	441	存在且小于443峰
197	小于基峰的1%	442	大于基峰的40%
198	基峰，丰度100%	443	442峰的17-23%

　　1.6.2.2 GC/ECD气相色谱系统检查，进行样品分析以前首先注入DDT和异狄氏剂，如果DDT分解为DDD和DDE的量及异狄氏剂分解为异狄氏醛和异狄氏酮的量超过15%，必须进行系统维护。
　　1.6.3 标准曲线的建立：
　　1.6.3.1 多环芳径标准曲线：多环芳烃标准系列进行GC/MS分析，计算各待测物的平均相对响应因子及相对标准偏差，平均相对标准偏差应小于15％。
　　1.6.3.2 多氯联苯及农药标准曲线：多氯联苯及农药标准系列进行GC分析，计算各待测物的平均相对响应因子及相对标准偏差，各化合物的平均相对标准偏差的平均值不大于20％，且平均相对标准偏差大于30％的化合物不应超过两个。
　　1.6.4化合物的定性定量方法：
　　1.6.4.1 多环芳径的定性定量：以保留时间及特征离子定性，用定量离子的相对响应因子定量。
　　1.6.4.2 多氯联苯及农药的定性定量：以目标化合物的保留值为依据定性，当色谱图上的峰落于目标化合物的保留值窗口内即可暂定检出，并用标准曲线平均相对响应因子进行浓度定量计算，样品的稀释因子（D）同上。
　　对照两柱的检出结果，当两柱均检出该目标化合物，且浓度的相对百分差不大于40% 则可确定该目标化合物的检出，将第一柱的分析结果作为定量结果报告。
　　若两柱检出浓度的相对百分差 (RPD) 大于40%，要检查是否有杂质峰干扰，或峰的积分基线是否合理，若经检查仍不能修正，应将较高值作为结果报告，并在数据报告说明中进行说明。若只在一根柱检出，则该化合物为未检出。注意：当两个被检物在某柱上不能分离，而在另一柱上均检出时，应报告能分离的柱的检出结果。

　　结果与讨论

　　2.1方法检出限
　　称10g纯净砂，加入50 L多环芳烃掺入用标准工作溶液(2µg/mL)及50 L农药及多氯联苯掺入用标准工作溶液(200ng/mL) ，与样品完全一样进行制备、分析。重复测定7次，测得化合物的标准偏差与95％置信水平的tr值之积为该化合物的检出限。

　　2.2 准确度与精密度的测定：称10g纯净砂，加入0.5 mL多环芳烃掺入用标准工作溶液(2µg/mL)及1 mL农药及多氯联苯掺入用标准工作溶液(200ng/mL) ，与样品完全一样进行制备、分析。重复测定4次，计算平均回收率及相对标准偏差。
　　表2及表3分别列出了多环芳烃、有机氯农药和多氯联苯的准确度、精密度及检出限。结果表明：多环芳烃、多氯联苯及有机氯农药在中等浓度范围的回收率在43％~170％，相对标准偏差在3％~18％。在低浓度范围的回收率在40％~160％；多环芳烃MDL在 2~4g/kg，多氯联苯及有机氯农药MDL在0.1~2.2 g/kg。如果条件允许时应采用质谱协助有机氯农药和多氯联苯定性。

　　2.3样品分析的质量控制与保证
　　2.3.1 每20个样需要与样品同时进行如下质控样的分析：
　　空白样品：以空白砂做基质，与样品同法分析。
　　实验室空白加标：以空白砂，分别加入0.5mL多环芳烃掺入用标准工作溶液(2µg/mL)及0.5mL农药及多氯联苯掺入用标准工作溶液(200ng/mL)标准添加液，与样品同法分析，计算其回收率。各目标化合物的回收率应在30-130％之间。
　　样品加标及其平行样：取三份平行样，其中两份各分别加入，与样品同法分析，计算回收率和相对标准偏差。各目标化合物的回收率应在30-130％之间，相对标准偏差应不大亍40％。
　　2.3.2 替代标准物的使用：所有样品在前处理开始前都加入了替代标准物，用以监视样品分析全过程中待测物的损失情况。各种实际样品替代标准物的回收率40%~85％。数据表明，样品中同时加入了多环芳烃、农药及多氯联苯的替代标准物，二者互不干扰。
　　2.3.3 仪器性能及标准曲线的核查：仪器每运行12小时按照1.6.2要求要对其性能进行检查。每12小时要分析标准曲线中间点浓度的标样，以验证标准曲线。各目标化合物的测出值与期待值的差别不应大于15％。

　　2.4 注意亊项
　　样品制备过程中萃取液多次经历浓缩步骤，浓缩过程中温度过高或氮气流过大会造成低沸点化合物损失。生物样品中常含大量脂肪、蛋白质等大分子有机物，会随目标物同时被提取出来，需经过复杂的净化步骤去除。但若这些大分子有机物含量过高，会导至硅胶柱及凝胶柱过载，故当分析脂肪样品时，取样量不宜超过1g。　　
　　表2多环芳烃的准确度、精密度及检出限的验证数据

化合物名称	空白加标 (100 g/kg)			空白加标(10g/kg)
化合物名称	四次平均值(g/kg)	平均回收率 (%)	相对标准偏差 (%)	七次平均值 (g/kg)	平均回收率(%)	标准偏差 (g/kg)	MDL (g/kg)
萘	61	61	6.2	5.4	54	1.0	3
2-甲基萘	62	62	7.4	4.9	49	1.1	3
1-甲基萘	66	66	10.0	5.4	54	1.0	3
联苯	68	68	7.8	5.4	54	1.0	3
2，6-二甲基萘	65	65	8.1	4.9	49	1.6	5
苊烯	67	67	8.2	5.1	51	1.1	3
苊	72	72	7.1	5.7	57	0.8	2
2，3，5-三甲基萘	69	69	6.7	5.1	51	1.1	3
芴	76	76	8.8	5.7	57	1.4	4
二苯并噻吩	74	74	6.5	6.3	63	0.8	2
菲	67	67	5.6	6.9	69	1.1	3
蒽	85	85	6.3	6.3	63	0.8	2
1-甲基菲	86	86	5.1	6.9	69	1.1	3
荧蒽	84	84	6.4	6.6	66	1.0	3
芘	86	86	6.5	7.7	77	0.8	2
苯并(a)蒽	85	85	8.7	8.3	83	1.4	4
屈	83	83	4.6	7.4	74	1.0	3
苯并(b)荧蒽	75	75	7.4	6.9	69	1.1	3
苯并(k)荧蒽	43	43	7.4	6.6	66	1.0	3
苯并(e)芘	65	65	4.9	5.7	57	0.8	2
苯并(a)芘	69	69	4.9	5.7	57	0.8	2
二苯并(a,h)蒽	58	58	8.4	4.3	43	0.8	2
茚并(1,2,3-c,d)芘	62	62	7.9	6.0	60	1.2	4
苯并[g,h,i]苝	61	61	5.2	5.4	54	1.0	3

　　注：样品量10克，凝胶色谱净化过程中稀释倍数2。
　　表3双柱分析有机氯农药和多氯联苯的准确度、精密度及检出限的验证数据

化合物名称	空白加标 (20 g/kg)				空白加标(1.0µg/kg)				检出限 MDL(µg/kg)		化合物名称		空白加标 (20 g/kg)						空白加标(1.0µg/kg)				检出限 MDL(µg/kg)
	回收率(%)		CV（%）		回收率(%)								回收率(%)			CV（%）			回收率(%)
	柱1	柱 2	柱1	柱 2	柱1	柱 2		柱1		柱 2			柱1		柱 2	柱1	柱 2		柱1		柱 2		柱1		柱 2
PCB 8	60	65	2.6	4.7	111		111		0.9	1.5	PCB 77		73		170	7.2	4.7		69		159		0.3		0.4
α-BHC	62	60	3.5	4.7	49		55		0.1	0.1	异狄氏剂		79		87	4.3	3.5		60		108		0.2		0.3
六氯苯	69	61	2.9	5.2	71		56		0.2	0.2	o,p'-DDT		92		85	4	4.2		86		88		0.3		0.2
PCB 18	61	71	5.8	18	77		124		0.4	0.9	PCB 118		79		142	3.4	5.5		81		125		0.2		0.5
γ-BHC	64	60	4.1	4.8	64		57		0.2	0.1	顺式九氯		95		93	4.5	5		86		91		0.3		0.2
β-BHC	83	64	4.4	5.9	116		58		0.5	0.2	p,p'-DDD		84		77	5.6	6.3		66		62		0.2		0.2
PCB 28	65	66	3.1	3.1	73		99		0.8	0.9	PCB 153		80		74	3.5	4.5		78		106		0.2		0.3
δ-BHC	72	66	2.2	2.5	62		64		0.2	0.2	硫丹 II		73		142	6.4	5.5		57		124		0.1		0.5
七氯	62	65	3.6	2.5	55		111		0.1	0.5	PCB 105		108		78	14	4.4		154		115		1.1		4.6
PCB 52	63	56	4	2.9	127		131		0.4	0.3	异狄氏醛		61		57	8.2	8.5		54		52		0.1		0.1
艾氏剂	61	133	2.6	3.8	51		116		0.1	0.3	PCB 138	169		75		4.8		4.4		152		82		0.5		0.3
PCB 44	65	133	3.4	3.8	69		116		0.2	0.3	p,p'-DDT	169		85		4.8		5.4		151		85		0.5		0.4
氧化氯丹	81	85	3	4.3	76		92		0.2	0.3	PCB 187	87		72		4.5		4.2		117		79		0.4		0.2
环氧七氯	77	72	3.8	3.8	71		74		0.2	0.2	硫丹硫酸盐	87		109		6.9		14		82		162		0.2		0.6
PCB 66	71	69	2.3	2.6	75		72		0.3	0.2	PCB 126	87		73		5.7		12		101		68		0.5		0.3
O,p'-DDE	89	85	2.6	5	84		80		0.2	0.2	PCB 128	82		77		4.9		5		106		80		0.3		0.3
PCB 101	80	72	2.2	14	79		61		0.2	0.3	甲氧滴滴涕	83		83		7.3		6.5		83		82		0.2		0.2
γ-氯丹	81	76	2.6	2.4	74		76		0.2	0.2	异狄氏酮	89		86		5.5		7.5		82		90		0.3		0.2
α-氯丹	74	77	2.8	4.4	67		82		0.2	0.1	PCB 180	82		87		4.8		4.1		82		82		0.4		0.3
硫丹 I	73	71	4.2	4.3	69		75		0.2	0.1	PCB 170	87		79		9.2		6.4		85		80		0.3		0.2
反九氯	82	87	3.1	4.2	69		88		0.2	0.2	灭蚁灵	90		87		3.6		4.2		93		102		0.3		0.2
P,p'-DDE	83	74	3.3	3.5	70		72		0.2	0.2	PCB 195	93		88		6.3		6.2		90		89		0.2		0.3
狄氏剂	80	75	4.9	5	77		71		0.2	0.1	PCB 206	92		90		5.9		6.5		136		91		2.2		0.2
O,p'-DDD	86	167	5	4.7	97		155		0.3	0.4	PCB 209	88		94		4.8		6.2		94		103		0.3		0.5

　　
　　参考文献：
　　[1] 曲健等，生物组织样品中微量多环芳烃的测定[J].中国环境监测，2004,20(2)：25-27
　　[2] US. EPA. Method 8082 Polychlorinated Biphenyls (PCBs) by Gas Chromatography. SW 846, 1996.
　　[3] US. EPA. Method 3545 Pressurized fluid extraction. SW 846, 1996.
　　[4] US. EPA. Method 3665A Sulfuric acid/permanganate cleanup. SW 846, 1996.
　　

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