不同载体固定高效降解菌去除水体中石油的研究

中国环境学会  2011年 03月31日

      何丽媛1, 2,郭楚玲1, 2,党志1, 2*
  1.华南理工大学环境科学与工程学院,广州 510006
  2.工业聚集区污染控制与生态修复教育部重点实验室,广州 510006
   
  摘要: 本研究采用表面吸附的方法将石油降解菌GS3C进行固定化,三种固定化载体稻草秸秆、玉米秸秆及蒙脱石与未固定化菌对原油去除效果分别为86.20%、50.03%、51.76%,均高于单纯投加菌液的原油去除率35.52%,确定固定化的最佳载体为稻草秸秆,其最佳投加量为1.5g/30mL培养液。


  关键词:微生物固定化;原油;生物降解;GC-MS
   
  引言


  固定化微生物技术是用化学的或者物理的手段和方法将游离微生物限制或定位在某一特定空间范围内,保留其固有的催化活性,且能够被重复和连续使用的现代生物工程技术[1]。目前,固定化技术被广泛的应用于废水处理,它具有菌体密度高,耐毒性能力强,可重复使用等优点。虽然应用生物法降解石油以及固定化微生物技术处理有机污染物的实例很多[2-4],但是有关固定化降解石油菌的报道却不多见。朱文芳等研究表明[5],在固定化微生物反应器中处理的除油效率比相同条件下未经固定化反应器可提高约20%。张秀霞等[6]将固定化微生物应用于含有石油污染物土壤的生物修复,50 h的原油降解效果保持在85%以上。
  本研究是采用表面吸附固定技术,将石油降解菌附着于固体载体上,增加菌与原油的接触面积,从而提高原油降解效果。


  2  材料与方法


  2.1 材料和试剂
  菌种:烷烃降解菌GS3C[7],洋葱伯克霍尔德氏菌( Burkholderia cepacia);
  固定化培养基:蔗糖10.0g,牛肉膏6.0g,酵母粉1.5g,水1000mL,pH8.0;
  富集培养基(LB):胰蛋白胨10.0g,酵母粉5.0g,NaCl 5.0g,pH7.0;
  无机盐基础培养液(MSM)[8]:5.0 mL磷酸盐缓冲液(8.5g•L-1 KH2PO4,21.75 g•L-1 K2HPO4·H2O,33.4 g•L-1 Na2HPO4·12H2O,5.0 g•L-1 NH4Cl),3.0 mL MgSO4水溶液(22.5 g•L-1),1.0 mL CaCl2水溶液(36.4g•L-1),1.0 mL FeCl3水溶液(0.25g•L-1),1.0 mL微量元素溶液(39.9 mg•L-1 MnSO4·H2O,42.8 mg•L-1 ZnSO4·H2O,34.7mg•L-1 (NH4)6Mo7O24·4H2O),1 L蒸馏水,调pH为7.0;
  原油培养基:原油5.0ml,无机盐基础培养基1000mL,pH7.0。
  基金项目:广东省自然科学基金研究团队项目(No. 9351064101000001);广东省自然科学基金重点项目(No. 05103552)
  载体分别为稻草秸秆、玉米秸秆和蒙脱石。


  2.2微生物的富集
  将GS3C从平板挑一环至 50 mL富集培养基中,30 ℃、180 r/ min 摇瓶培养 48 h,获得高浓度菌液。


  2.3表面吸附固定化微生物的方法
  将载体加入装有30mL固定化培养基的锥形瓶中,接种2mL的GS3C菌液,30℃摇床,转速 180r/min,振荡培养36h后滤出载体,用生理盐水洗涤2次[9]。


  2.4原油去除率的测定方法
  每瓶加入30mL正己烷放入超声波清洗器中超声萃取5min,并将培养液 4500 r·min-1离心 10min, 上层有机相用正己烷定容至50mL,取0.5mL溶液用正己烷稀释至25mL,加入少量无水硫酸钠干燥,用紫外-可见分光光度计测量各溶液的吸光度值,对照原油的标准曲线,求算去除率[10]。采用GC-MS测定石油烃的总量以及降解前后各组分的变化情况。
  原油去除率 =(原油浓度—培养液原油浓度)/原油浓度 × 100%


  2.5固定化菌与未固定化的菌降解原油的对比实验
  原油培养基中分别加入GS3C菌液、分别以相同质量的玉米秸秆、稻草秸秆、蒙脱石为载体固定的微生物GS3C,30℃摇床,转速180r/min,振荡培养72h,测其原油去除率。


  2.6不同载体最佳投加量的确定实验
   3种载体分别取0.25、0.5、1、1.25、1.5、1.75、2.0g(干重)投加到装有30mL固定化培养基中,固定36h后,把得到的固定化GS3C加入原油培养基中,30℃摇床,转速 180r/mln,振荡培养72h,测其原油去除率。


  结果


  3.1 固定化菌与未固定化的菌降解原油的对比
   如图所示,固定化GS3C的原油去除率均高于单独投加GS3C菌液的原油降解率,其中稻草秸秆的去除效果最佳,达到了86.20%,比未固定化的纯菌提高近50%。这说明,在用石油降解菌的基础上加入微生物固定化技术,可以得到更好的原油去除效果。在降解过程中,稻草秸秆对原油的分散效果最好,蒙脱石次之,而游离GS3C的油膜最厚,挂壁现象最严重。载体的加入对原油起了很好的分散作用,分散后的原油吸附在载体表面,形成了大量油/水界面,有利于界面上的原油的生物降解。固定化载体内部有较好的孔隙度,可以不断利用原油油进行细胞增殖,并且载体对固定化的微生物起到保护作用[11]。同时培养基中还有一部分悬浮游离的微生物,与载体中的微生物同时在油/水界面中对原油起到降解作用[12]。所以固定化微生物的原油降解效果明显优于单一游离微生物。
  紫外分光光度法通常只能测定原油组分中的芳香族化合物以及带共轭双键的化合物,不能测定原油中的饱和脂肪烃类化合物,而GC-MS可以更好地测定石油烃的总量以及降解前后各组分的变化情况[13]。因此将培养液的残油用正己烷萃取后进行GC-MS分析,结果如图2所示。   
  谱图中大多数物质的碎片离子峰十分相似,为烷烃类同系物。因此,原油样品中绝大部分组分为烷烃类化合物,以碳原子数为10~25的居多,只有少量为芳香烃类化合物[14]。稻草秸秆的谱图中绝大部分直链烷烃被去除,按总峰面积计算其去除率达到81.65%,降解效果最佳。蒙脱石的降解效果次之, 对C<20的中短链烷烃去除效果比较明显,去除率为49.82%。而玉米秸秆的去除效果与未固定化的纯GS3C无明显差别。


  3.2 不同载体最佳投加量的对比
  稻草秸秆固定化菌对原油去除率随着投加量的增加而提高,稻草秸秆的最佳投加量范围为1.5-2.0g(干重),其中当投加量为2.0g (干重)时原油去除率最大,达到89.04%。 
  玉米秸秆的最佳投加范围为0.75-2.0g(干重),其中当投加量为2.0g (干重)时玉米秸秆固定化菌对原油去除率最大,达到58.86%。  
  蒙脱石的最佳投加范围为0.5g (干重),此时蒙脱石固定化菌对原油去除率达到最大40.77%,然后随着投加量的增加去除率反而下降。   
  可见,固定化载体并非投加得越多其固定化菌去除原油的效果就越好,投加量过多或者过少都不利于菌对原油的去除。当处理时间相同时,投加载体过少将导致微生物可以吸附生长的载体少,形成的油/水界面也少,因而原油去除率较低。投加载体过多时,培养基中载体吸附的菌体过多,使得菌体的营养不足,其新陈代谢和生长的速度减缓,降低对原油的去除速度[15]。同时恶劣的生长环境可能使微生物会产生一些抑制自身生长甚至导致自身死亡的次生代谢产物,微生物的存活量将极大地降低,也影响到微生物对原油的去除。
  以上结果表明,蒙脱石的投加量虽然少,但是对原油的去除率却最低。而在投加量相当的情况下,稻草秸秆固定化菌对原油的去除率显著高于玉米秸秆固定化菌,因此确定最佳载体为稻草秸秆,投加量为1.5g(干重)时最经济有效。
   
  4 结论


  (1)固定化微生物既利用载体内部较大的孔隙度增加菌密度,又利用载体对原油良好的分散作用促进微生物对原油降解,使其去除率明显优于未固定的游离微生物。其中载体稻草秸秆的效果最佳,去除率达到了86.20%,比未固定化的纯菌提高近50%。
  (2)蒙脱石的投加量虽然少,但是对原油的去除率却最低。而秸秆类在投加量相当的情况下,表现出较强的吸附能力,促进了对原油的降解。稻草秸秆固定化菌对原油的去除率较高,因此确定最佳固定化载体,投加量为1.5g(干重)。
   
  参考文献
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