胞外聚合物(EPS)构成的影响因素分析

中国环境学会  2011年 03月31日

  曹秀芹   赵自玲 (北京建筑工程学院环境与能源工程学院,北京100044)


  摘要:污水生物处理系统中污泥胞外聚合物EPS对系统性能变化起到重要的作用,其含量反映污泥中微生物特性及构成的变化,并进而影响到污泥特性和系统的处理效果。但由于EPS影响因素众多,因而目前尚缺乏标准的分析方法。文中对EPS的影响因素进行综合分析,其中影响因素主要包括废水基质以及工艺运行条件如污泥负荷、溶解氧、停留时间等,并对不同的EPS提取方式及其组分测定方法进行了比较分析。随着人们对EPS及其作用认识的不断深入,必将对污水生物处理系统处理效果的有效控制起到重要的推动作用。
  关键词  胞外聚合物(EPS),废水基质,工艺条件,提取方法


  Analysis of influencing factor on the component of Extracellular polymeric substance (EPS)
  Cao Xiuqin, Zhao Ziling
  (School of Environment and Energy Engineering, BUCEA. Beijing 100044)
  Abstract: Extracellular polymeric substance (EPS) in biological wastewater treatment system, incarnating the function and composition of microorganisms, would contribute obviously to sludge characteristics and the performance of the system. However, standard method for measuring EPS has been not determined because of its numerous influencing factors. Therefore, the factor of EPS was analyzed synthetically in this paper, such as the influent components and operating conditions, which including sludge loading, dissolved oxygen and hydraulic detention time. Different extracting mode and measuring method were also comparatively analyzed. It would accelerate the control effect on the treatment efficiency of biological treatment system by further study on EPS and its function   
  Key Words: Extracellular polymeric substance(EPS), influent components, operating conditions, extracting mode


  胞外聚合物EPS(Extracellular polymeric substances)是活性污泥絮体中继水分和细胞后的第三大组成部分[1],其来源 [2-4]一是由细菌细胞新陈代谢分泌的高分子聚合物,聚集在细胞外部形成凝胶状物质,二是来自于污废水中的化合物,即污泥所处的基质环境。因此,EPS在活性污泥絮体中普遍存在,且其成分非常复杂,由大量聚合物构成。这种聚合物聚集在细胞外部形成保护层以抵制外界环境的压力,同时也起到储备碳源和能源的作用。多数研究表明[2,5-7],EPS的70~80%是由蛋白质和多糖构成,余下的20~30%来自于腐殖酸、核酸和脂类等。然而由于目前污水生物处理系统污泥中EPS影响因素众多,且缺乏标准的分析方法,不同废水的特征、反应器运行条件和微生物群体都会导致EPS 总量及各组分的比例不同,甚至相差很大。
  近年来,微生物的胞外聚合物特性及组成研究日益引起广泛地关注( Frolund et al. ,1996; Liu et al., 2002; 周建等, 2004;沈荣等,2008;Ni et al.,2009等 )。EPS是微生物在特定环境下产生的分子量大于10000 的高分子物质,其成分和含量与微生物的活性和功能特性有着密切联系,分析其化学组成是理解整个生物絮凝、污泥稳定性以及生物代谢机制的重要基础。EPS的测定通过其主要构成成分蛋白质、多糖等组分的测定来体现,其中蛋白质的定量测定方法很多,目前在胞外聚合物测定中应用较广的有Folin酚法、考马斯亮蓝法和凯氏定氮法以及分子生物学的探针法等。本文对废水基质和各种污水处理工艺运行条件对EPS的影响以及不同的EPS提取方式及其组分测定方法进行了比较分析。
   
  1 废水基质对EPS组成的影响
   
  EPS 含量及其成分的变化与污水处理系统的进水基质有着密切的关系,随着废水基质营养水平的不同,污泥系统中的优势菌种也不同,进而影响着细菌分泌的EPS 产量。
  Sponza[8-9]发现酿酒工业废水的活性污泥和城市污水的活性污泥EPS以蛋白质为主,其含量为70~71 mg/ gMLVSS,核酸含量仅为6. 2~6. 5 mg/ gMLVSS;而化学、皮革、染料3 种工业废水的活性污泥中蛋白质和核酸含量相差不大,分别为24~48 mg/ gMLVSS和11~12 mg/ gMLVSS。葛利云[10]等实验发现用淀粉基质培养的污泥EPS总量比用葡萄糖基质培养的污泥略高一些,它们都比实际污水处理厂污泥的EPS含量高。另外不同的培养基质还会影响污泥EPS的蛋白质与多糖的比值。淀粉基质培养的污泥比葡萄糖基质培养的污泥的EPS中蛋白质与多糖的比值要高。吴志高[11] 通过试验得出随着进水碳源含量的升高(氮、磷相对缺乏),污泥EPS及其中的多糖、蛋白质等的含量分别有着不同程度的增加。分析表明可能是由于细菌与丝状菌在低营养比条件下进行竞争,丝状菌成为优势菌种导致了一些形成絮体的细菌死亡解体;另外氮、磷营养成分的不足降低了微生物的同化作用,使得絮体中微生物大量死亡以及细胞自溶导致了EPS中蛋白质、多糖等含量的增加。
   
  2 污水处理工艺运行条件对EPS组成的影响


  2.1污泥负荷对EPS组成的影响
  关于有机负荷对EPS 组成的影响早期的研究认为两者具有负相关性,即低负荷处于内源生长期的污泥比高负荷污泥EPS产量高[12]。并从细胞自溶的角度分析,表明污泥负荷对EPS有显著影响,且随着污泥负荷的降低EPS含量增加。因为随着负荷降低,细菌可利用的基质减少,增殖速率降低,此时细菌的分泌和自溶使低负荷污泥中EPS含量较高。周健等[13]研究也发现EPS及多糖含量与污泥负荷呈负相关性,当污泥负荷由0.3 kgBOD5/ (kgMLSS.d)增加到3 kgBOD5/(kgMLSS.d)时,EPS由23.4mg/gVSS减少至14.5mg/gVSS;多糖由11.6mg/gVSS减少至6.92mg/gVSS。但也有研究者[14-15]认为两者具有正相关性,并从碳源积累的角度分析其原因是在较高的污泥负荷条件下,微生物细胞无法将所有碳源用于细胞合成,多余碳源被转化成胞内聚合物和在EPS中积累的胞外高分子物质,使得EPS含量增加。


  2.2 溶解氧对EPS组成的影响
  系统DO(溶解氧)含量不同使得微生物构成及其代谢活动发生变化,微生物分泌的EPS产量和成分也显著不同。Sponza[9]发现污泥在DO为0. 5~2 mg/ L时,蛋白质、糖类和核酸含量都随着DO增加而升高;当DO降到0. 1 mg/ L 以下时蛋白质和核酸含量开始下降,进入厌氧状态后进一步减少。周健等也发现当DO从0增加到4.2 mg/ L时,污泥的胞外聚合物EPS及其中蛋白质、多糖含量逐渐增加。分析表明随着DO增加,微生物具有较强的新陈代谢能力,通过分泌及自溶产生了较多的EPS。当DO降低到0时,EPS含量明显降低,这是因为厌氧微生物菌种不同,分泌的EPS较少的缘故。但Shin等[16]却得出不同的结论,他们发现DO高时多糖产量会增加,但蛋白质保持不变;且随着DO的降低、EPS各组分都无明显变化。另外,DO对污泥及上清液中EPS影响也有不一致。李延军等[17] 通过对好氧颗粒污泥中EPS在污泥和上清液中的分布,发现随DO的升高,污泥中多糖、蛋白质及EPS总量缓慢增加,蛋白质含量约为多糖的2~3倍,DO达到4. 5 mg/ L 后总量趋于稳定;而上清液中当DO低于4. 5 mg/ L 时,蛋白质和多糖浓度及其EPS总量随DO的升高而降低。分析原因:一方面是较高的DO使得微生物能够进行正常的代谢活动,污泥颗粒解体释放的EPS 逐渐降低;另一方面随DO的升高,微生物的代谢活动加剧,底物消耗加快,污泥产生的部分EPS被微生物作为底物利用,因此释放到上清液中的EPS总量随DO升高而不断降低,但当DO达到4. 5 mg/ L 时,足够的DO到达颗粒污泥中心区域,较快的底物消耗造成营养缺乏而使微生物进入内源呼吸,分泌的EPS又开始增加,并与其消耗达到平衡。


  2.2.3 温度对EPS组成的影响
  Wilèn[18]等在研究实际活性污泥工艺的活性污泥絮体构成及絮凝性和沉降性时发现,在冬季时,活性污泥EPS中蛋白质成分明显增多。张宝良[19]等通过对哈尔滨市文昌污水厂的市政污泥、哈尔滨市可口可乐公司废水处理厌氧污泥、可乐废水好氧处理污泥3种不同类型的污泥试验分析温度对污泥EPS含量及成分的影响,- 20℃下储存EPS组分保持最稳定,室温下储存效果最差,4℃储存情况介于前二者之间。对于市政污水污泥和可乐废水好氧处理污泥EPS,适于在- 20℃下储存,此时两类污泥EPS中蛋白质分别下降9%、20%,糖下降均为20%;而可乐废水厌氧处理污泥EPS在3种温度下组分浓度下降幅度均较大(室温:蛋白质85% ,糖80%;4℃:蛋白质80%,糖70%;- 20℃:蛋白质30% ,糖60% ) 。周健[13]等通过试验得出温度对EPS也有明显的影响,在10℃的反应器中,污泥EPS较高,同时其中DNA 及蛋白质含量较高,可能是细胞死亡而释放出的胞内聚合物,导致EPS增加;当温度从10℃升至15℃时污泥的EPS降低,其中DNA 及蛋白质含量降低;当温度从15℃ 升至30℃ 时,EPS反而 增加了14%,其中DNA及蛋白质含量增加不明显,但多糖含量明显增加。这是由于温度对细胞的生理活动影响较大,随着温度提高,酶促反应速度将提高,同时微生物的代谢速率和生长速率较高,此时主要是由于细菌的分泌导致EPS升高。
 

  2.2.4 PH对EPS组成的影响
  郑蕾[20]等通过对市政污水污泥和可乐废水污泥试验发现提取的EPS浓度与pH有着密切关系。在强酸条件下(pH=3),可提取EPS比pH =7时下降约50 % ,其中多糖下降约30 %,蛋白质下降65 %~70 %;在强碱条件下(pH =11),可提取EPS比pH =7时升高20 %~30 % ,其中多糖升高约15 %,蛋白质升高20 %~50 %。周健[13]等试验也发现pH对EPS的成分比例有明显的影响,在pH=5~6的酸性条件下产生的EPS较少,当在pH=7的中性和pH=8的偏碱性条件下,微生物产生的EPS增加,pH=9的碱性条件下,微生物产生的EPS明显增加。可能是碱性条件下,随着pH增加微生物死亡数量增多,从而释放出大量的胞内聚合物而导致EPS增加。李延军等[17] 得出pH值为7时好氧颗粒污泥EPS含量最大,蛋白质是其主要成分;当pH值为5.5 和8.5 时,EPS含量均下降,但变化幅度不大,多糖含量略高于蛋白质;而上清液中EPS酸性条件下含量最大,成分以多糖为主。分析认为是酸性条件不利于颗粒污泥形态保持和微生物生长,部分微生物自溶分解,大量EPS被释放到上清液中,微生物为抵抗环境pH值压力而分泌吸附的多糖量超过蛋白质含量。


  2.2.5 固体停留时间(SRT)对EPS组成的影响
  Liao 等[21] 通过中试SBR反应器研究了SRT为4~20d的EPS含量及组分的变化,发现总的EPS含量并不随着SRT的变化而有明显改变,而且这已被Gulas [22]于1979年发现。Liao发现,在SRT为4~9d时,其中的糖类明显减少,蛋白质明显增加,16~20d后,糖类与蛋白质的比例趋于稳定。在SRT较短时,糖类显著减少可能是由于污泥中的微生物来不及将所有碳源用于生长,多余的碳源被转化为胞内聚合物以及形成胞外聚合物EPS。


  2.2.6 金属离子对EPS组成的影响
  由于EPS含较多的硫酸根、磷酸根和羧基等负电官能团,而氨基等正电官能团较少,因而几乎所有活性污泥表面电荷都为负值[23],而废水中的金属离子呈正电性,因此胞外聚合物可以和金属离子之间相互作用。例如,铬可以与胞外聚台物相互作用,导致胞外聚合物结构变化。曹相生等[24]试验确定Mn2+、Mo6+和Zn2+的最佳促进浓度均为l mg/L;在各自促进浓度范围内,Mn2+、Mo6+和Zn2+对EPS各组分的影响程度不同:低浓度(0.05 g/L)Mn2+导致EPS中蛋白质、多糖和核酸含量下降,蛋白质与多糖的比值不变;Zn2+使EPS中多糖含量改变,进而导致蛋白质与多糖的比值减小;Mo6+则对EPS各组分基本没有影响。周健[13]试验发现当进水中的Ca2+由0增加到1mmol/L时,EPS中各成分的比例和含量变化较为明显。EPS总量增加了60%,其中DNA所占的份额减少了10%,蛋白质所占的份额增加了7%,多糖所占的份额增加了6%。董德明等[25]发现在胞外聚合物中Mn的存在会影响其对Pb和Cd的吸附。这说明不同金属与胞外聚合物的作用机制存在一定差别,因此当一种金属吸附达饱和后,其他种类的金属可以继续在胞外聚合物上进行不同程度的吸附。
   
  3 提取方法和测量方法对EPS组成的影响


  3.1 提取方法对EPS组成的影响
  除上述因素影外,EPS提取的方法不同也是造成EPS的含量及其组成不同的主要原因。目前常用的EPS提取的方法可分为两大类:物理方法和化学试剂法。物理提取法包括高速离心法(Murthy et al .,1999 [26])、超声波法( Jorand et al .,1995 [27]) 和热提取法(Morgan , et al . ,1990 [28]);化学提取法包括投加酸、碱、乙醇,醛类、EDTA 和阳离子交换树脂(CER) 等,这些化学药剂使EPS的大分子在试剂离子或分子的作用下成为水溶性成分,从而被提取出来。Liu 和Fang [29]在20000r/30min的高速离心下分离提取EPS,结果表明每克活性污泥可提取出7.3mgEPS,其中蛋白质6.5 mg,多糖0.8 mg。同样的污泥在80℃下用加热法提取,则可提取出的EPS的量是前者的8倍 (57.9 mg)、多糖的量是前者的18倍、蛋白质的量是前者的7倍, 蛋白质与多糖的比值可以从8.6 降到3.5。罗曦等[30]采用5种方法对同一污泥在好氧和厌氧条件下的胞外聚合物进行了提取试验,结果表明:甲醛-NaOH和硫酸法对EPS的提取产量最高,分别为232.0、159.7 mg/g且无大量细胞自溶的现象发生,是比较有效的提取方法;阳离子交换树脂对厌氧和好氧状态下污泥中胞外多糖的提取量仅7.6~9.4 mg/g;而戊二醛提取方法多糖的测定有严重的干扰,同时发现两种污泥EPS中蛋白质的含量均最高,占EPS总量的50%~80%;其次为胞外多糖和DNA。王暄等[31]采用4种方法(热、超声、高压、碱处理)分别研究在不同的作用时间和方式下对好氧颗粒污泥EPS的提取效果,综合比较各提取方法的提取效果表明热处理(80℃、30 min)和超声波提取(320 W、40 s)法均是可行的,其中热处理提取产物中多糖、蛋白质分别为30.3、8.1 mg/gVSS,而超声波则分别为24.3、10.8 mg/gVSS。好氧颗粒污泥EPS中多糖含量高于蛋白质,在热处理及超声波提取的产物中,多糖与蛋白质之比分别为3.7和2.3。
  好的EPS提取方法是在不破坏细菌细胞的前提下,有最大的EPS提取量。也有研究者尝试将多种方法进行有效的结合。李绍峰[32]等通过试验验证与单纯的树脂法相比,超声树脂联用提取效果更好,EPS的提取量比树脂法高约35 %,而测得的DNA含量相对低,即对细胞的破坏程度较小。Liu等[29]对甲醛- 氢氧化钠、甲醛- 超声波、EDTA、阳离子交换树脂(CER)和甲醛5种方法提取活性污泥的效果进行了比较,发现甲醛- 氢氧化钠法的EPS产量最高,且前期加入少量甲醛能明显增强细胞壁强度和防止微生物死亡。提取效率其次为甲醛- 超声波法,而单一方法EDTA、CER和甲醛- 氢氧化钠提取效果都不理想。


  3.2 测量方法对EPS组成的影响
  通过测量EPS中的糖类、蛋白质、腐殖质和DNA等确定EPS含量,然而这些组分的测量方法不是唯一的,测量方法本身将影响提取的EPS含量。EPS组分的测量常采用分光光度法,该法通常将EPS中的待测成份消解,生成水解产物,然后投加显色剂与水解产物发生显色反应,根据显色反应的颜色深浅程度来测定样品中化学成分的含量。下面以多糖、蛋白质为例比较不同的测量方法所测结果。


  3.2.1多糖的测定
  蒽酮法[33]和硫酸-苯酚法是最常用的多糖测定方法。Frolund等[1]用蒽酮法和硫酸-苯酚法测量EPS中的多糖含量,两种方法得到了相近的测量结果。Benetti[34]采用葡萄糖作为标准物质,用蒽酮法和硫酸-苯酚法分别测量含有50g的葡聚糖、黄原胶、褐藻酸的样品。结果发现采用蒽酮法比硫酸-苯酚法有更高的回收率;并且,蒽酮法测葡聚糖和黄原胶的多糖含量分别为实际值的108%和82%,而采用硫酸-苯酚法测同样的样品,测得的多糖含量只为实际值的69%和61%。此外,蒽酮法测量褐藻酸中的多糖含量比硫酸-苯酚法更接近实际值,且标准偏差要小得多。


  3.2.2蛋白质和腐殖质的测定
  Folin-Lowry法是对双缩脲法的修正,前者使蛋白质的测定有更高的灵敏度。Frolund[1]等用考马斯亮蓝染色法、Folin-Lowry法、修正的Folin-Lowry法测量污泥和EPS中蛋白质的含量,并与含N量进行比较(N与蛋白质的换算系数为6.25),结果表明修正的Folin-Lowry法与含N量计算的蛋白质含量最为接近,说明采用修正的Folin-Lowry法测量EPS中蛋白质的含量最为可靠。因为修正的Folin-Lowry法与Folin-Lowry法的区别在于Folin-Lowry法的测定值包括了蛋白质和腐植酸的含量,导致对蛋白质含量的过高估计;而修正的Folin-Lowry法不仅对Folin-Lowry法中蛋白质的含量进行了修正,而且可以同时测量出腐殖质的含量。
  此外,近年中国科技大学化学系俞汉青等研究人员采用不同的光谱技术以及分子生物学的手段对EPS进行深入的研究。其中沈荣[35]等应用微相吸附-光谱修正技术,利用刚果红探针测定了活性污泥胞外聚合物中蛋白质的含量,研究表明与常用的Folin酚法比较,结果一致。Ni等[36]采用凝胶渗透色谱法和三维激发发射矩阵荧光光谱法研究活性污泥中混合菌种产生的EPS特征。研究表明EPS在底物利用期间显著增加,在内源呼吸期减少。并对EPS及其组成变化进行了动力学分析,模拟结果表明来自外源底物的电子分别以61%、21%和18%的比例用于合成新细胞、氧的消耗和EPS的合成.
   
  4.结论


  胞外聚合物EPS普遍存在于生物污泥絮体内部及表面,细胞借助EPS进行物质和能量的传递,它的含量及组成对污泥的理化性能以及生物处理系统内部电子流的分配转移起着重要的作用。随着研究的不断深入,人们对EPS及其作用有着更为清晰的认识,并更好地控制污水生物处理系统的处理效果,但还有待进一步深入探讨,尤其是EPS提取及分析方法仍需进一步标准化,同时已有的研究中,往往为避免进水基质对微生物分泌EPS分析的干扰,在研究中多采用配水,以乙酸或乙酸钠作为碳源。对实际污水的情况应采取措施有效区分EPS的来源,对进水中EPS成分可采用同位素示踪标记,以更准确地描述EPS特征、变化规律以及与污泥理化性能变化的关联性。
   
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