白腐真菌胞外生物合成蛋白质-Pb微米颗粒的研究

中国环境学会  2011年 03月31日

  王亮,陈桂秋,张文娟(湖南大学环境科学与工程学院,环境生物与控制教育部重点实验室,湖南 长沙 410082)
  作者联系方式:gqchen@hnu.cn   13307488887


  摘要:为了提高白腐真菌在处理重金属废水中的实际应用能力,必须探究其对重金属的胞外吸附和积极防御作用机制。在本研究中,通过摇瓶培养试验,发现了白腐真菌在处理低浓度重金属废水过程中,能够通过分泌胞外聚合物(EPS),对重金属离子进行络合,在菌体表面,胞外生物合成呈规则球状的蛋白质-Pb颗粒物,并且胞外聚合物(EPS)对颗粒形态存在显著的影响,高浓度铅对生物合成有明显的抑制作用。
  关键词:白腐真菌;生物合成;微米颗粒;胞外聚合物(EPS)


  一、引言


  去除工业废水中的重金属,对于保持水生环境、水生态系统和地下水圈是非常重要的环节。传统的处理方法主要是将重金属离子以氢氧化物形式沉淀或者用合成树脂进行离子交换。近年来,由于成本低廉和较高的离子交换容量,微生物技术越来越多地被用来处理重金属废水。而白腐真菌由于其独特的对异生物质的处理能力,既能降解难处理的有机污染物[1,2],也能应用于重金属废水[3,4],研究其处理重金属的微观机理正成为废水生物处理技术的研究热点。随着研究的深入,研究者发现白腐真菌除了对重金属的吸附,络合作用机制外,还存在另外一种作用机制——生物合成。
  JAROSZ等[5]研究发现,在添加了CaCO3、Co3(PO4)2和ZnO的平板培养基上接种三种白腐真菌:亚黑管菌Bjerkandera fumosa、脉射菌Phlebia radiata和云芝Trametes versicolor,分别产生了非常有序的Ca、Co、Zn的草酸盐晶体。MACHUCA和GALHAUP等人也发现在白腐真菌糙皮侧耳Pleurotus ostreatus、黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium、云芝T. versicolor 和绒毛栓菌T. pubescens等体外也发现有高水平草酸盐晶体的合成[6, 7]。
  与此同时,NADANATHANGAM研究[8]了在添加AgNO3的液体环境中培养白腐真菌黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium,发现培养24小时后菌丝体表面出现了大量的50到 200纳米的银纳米颗粒;随着培养时间的延长,纳米颗粒的数目和大小都有所增加。RASHMI[9]研究了云芝Coriolus versicolor在含AgNO3的液体环境中培养,发现其胞外也生物合成了大量Ag纳米颗粒。
  在本研究中,通过环境扫描电镜(ESEM)研究了白腐真菌另外一种生物合成途径,通过分泌胞外聚合物(EPS),生物合成呈球形的蛋白质-Pb微米级颗粒,以及考察了胞外聚合物(EPS)对生物合成的影响,以期对研究白腐真菌与重金属的胞外作用机制提高科学依据。


  二、材料与方法


  (一)菌种与培养基
  菌种为白腐真菌的模式菌种黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium BKMF-1767,购自武汉大学中国典型培养物中心。
  菌种平皿培养保存采用土豆汁培养基(1 L):葡萄糖20 g,琼脂20 g,新鲜土豆浸出液200 g,1000 mL蒸馏水,自然pH值。
  参考国内外学者的研究成果[10,11],本实验采用的种子培养基组成成分为(1L):10g葡萄糖,2g KH2PO4,0.5 g MgSO4,0.1 g CaCl2,0.001g维生素B1,0.2g酒石酸铵,无机溶液70 mL;pH为4.5。无机溶液(1L): 0.5 g MnSO4,0.1 g FeSO4·7H2O,0.1 g CoSO4,1.0 g NaCl,0.01 g CuSO4·5H2O,0. 01 g AlK(SO4)2, 0.1 g ZnSO4,0.01 mg H3BO3,0.01 g NaMoO4。
  接种前,培养基均在在105 ℃下灭菌30 min。
 

  (二)菌丝球培养和干重测定
  取4℃下保存的黄孢原毛平革菌平皿,在37 ℃下活化2 h后制备孢子悬液,接种5 mL孢子悬液到盛有50 mL种子培养基的250 mL的锥形瓶中,置于空气浴摇床中恒温培养(35 ℃,150 r/min),定时取样。
  由于白腐真菌是菌丝球,所以将整瓶培养物全部过滤后在105 ℃下干燥至恒重,称量,测定生物量干重。


  (三)胞外聚合物分离与分析
  通过改进的离心沉淀[12]方法来提取白腐真菌的胞外聚合物(EPS)。将一定培养时间的菌丝球悬液在4 ℃下以10000 r/min高速离心15 min (Sartorius 4K15,德国),上清液过0.45 μm滤膜后,加入4倍体积的体积分数为95%的无水乙醇,在4 ℃下保藏12 h,然后以10000 r/min离心10 min,所得的沉淀物为粗EPS。再将此粗EPS装入透析袋(MWCO,7kDa),密闭后置于室温下盛有去离子水的烧杯中,得到纯净EPS,用蒸馏水溶解,然后测定各组分和EPS量。用TOC自动分析仪(Phoenix 8000,美国)测定胞外聚合物(EPS)含量。


  (四)环境扫描电镜(ESEM)分析
  将菌丝球用蒸馏水洗涤两次,再用去离子水洗涤一次,其中一半提取EPS,用来得到不含EPS的菌丝球;另一半菌丝球用来吸附铅溶液,初始浓度为100 mg/L,35 ℃下吸附2 h后4 ℃保存12 h,所有样品均在自然风干后,采用环境扫描电镜(FEI Quanta-200,荷兰)分析。


  三、结果与讨论


  (一)白腐真菌胞外聚合物(EPS)产量
  将接种有孢子的液体培养基放入空气浴摇床中振荡培养,孢子浓度为2×105个,在培养时间41、65、89、113、137 h观察,取样,根据ULKU等[13]的结果,41 h相当于微生物生长的对数期,137 h相当于静止期末期,测定生物量干重和EPS含量,如表1所示。
  表1  黄胞原毛平革菌的胞外聚合物变化

  培养时间/h

EPS/mg.L-1

生物量干重/g.L-1

单位干重含EPS/ mg.g-1

41

94.5

0.828

114.13

65

109.0

0.922

118.22

89

119.3

1.114

107.09

113

125.5

1.612

77.85

137

118.6

1.556

76.22

  从表1可以看出,随着培养时间的延长,生物量干重和EPS产量都有显著的增长,而单位干重含EPS量呈现先增长,后下降的趋势。从30 h到113 h,黄胞原毛平革菌生长迅速,生物量干重从0.486 g/L增加到最大值,为113 h时的1.612 g/L,增长了3.3倍,EPS产量也迅速上升,从41 h时的94.5 mg/L,到113 h时达到最大值125.5 mg/L。113 h以后,由于各种营养物质的消耗殆尽,黄胞原毛平革菌出现衰亡现象,生物量干重和EPS产量均开始呈现较大幅度的下降。与此同时,单位干重含EPS量在65h达到最大值118.22mg/g后,一直呈现下降趋势,且幅度较大。此外,还可以看出,在培养41 h以后,EPS产量与生物量干重的变化趋势相同,并且均在113 h获得最大的生物量干重和EPS产量,因此可以得出EPS产量与黄胞原毛平革菌的生长有着非常紧密的联系,与Wang等[14]的研究结果相似。而单位干重含EPS量在65h取得最大值,表明此时白腐真菌含胞外聚合物EPS最丰富,与吴涓等[15]人研究的黄胞原毛平革菌菌丝球吸附量最大的培养时间为72 h的培养时间结果相似。


  (二)胞外聚合物(EPS)对菌体表面的影响
  白腐真菌生物合成作用主要发生在菌体表面,是一个有大量胞外酶参与,共同作用的生物化学过程,因此白腐真菌菌体的表面结构对生物合成具有重要作用。通过环境扫描电镜观察原菌丝球和提取完EPS的菌丝球表面结构,研究了胞外聚合物对菌体表面的影响,如图1所示。
  从图中可以看出,左图原菌丝球的环境扫描电镜显示,菌丝球由大量的球团状菌丝相互缠绕而成,球团之间接触紧密,相互连接在一起,而且菌丝球表面粘性的胞外聚合物丰富,这些都为吸附重金属离子提供了大量的可能的吸附位点,而提取完EPS后,菌丝球表面形态(右图)发生了显著的变化,表面结构呈现块状,大量的球团状结构消失,粘性的胞外聚合物大量减少,可能是提取过程中,高速离心造成菌丝球之间相互挤压,碰撞,胞外聚合物进入溶液所致。


  (三)胞外聚合物(EPS)对生物合成颗粒形态的影响
  为了探究胞外聚合物对生物合成的蛋白质-Pb微米颗粒形态的影响,利用环境扫描电镜对颗粒进行了研究,结果如图2所示。
  从图2可以看出,菌丝球在提取EPS前后,在吸附铅的过程中,均能生物合成球形颗粒,但是颗粒形态存在一定的差异。原菌丝球生物合成的颗粒,呈规则球体状,饱满,独立,粘附在菌体表面,而提取完EPS后菌丝球合成的颗粒,大体呈现球状,但均不是独立存在,球体一部分与菌体连接,欠饱满,对生物合成的颗粒进行了粒径测定,发现,其粒径均在10微米左右,与纳米级的贵金属颗粒存在显著的粒径差异。


  (四)球形颗粒的组成结构分析
      为了证明2种球形颗粒的组成是否存在差异,并分析球形颗粒的组成性质,对图2中箭头所示的两球形颗粒物(A、B)进行了X射线光散射能谱(EDX)分析,结果如图3和表2所示。
  表2  颗粒A、B的元素组成

  元素含量(%

颗粒C

颗粒D

C K

65.84

66.09

O K

20.59

22.85

P K

1.75

1.05

K K

0.99

0.48

S K

0.44

0.34

Pb K

0.66

0.55

  从图3、表2可以看出,颗粒A、B不存在元素组成上的差异,均是一种混合物、不是单一的微米级颗粒,这点与Ag等贵金属纳米颗粒存在组成差异,颗粒A、B均形成C、O、P和K峰,其中C和O的峰值较强,P、K、S、Pb的峰值较弱;各元素组成也较相近,不存在较大的差异。S吸收峰表明,颗粒中含有蛋白质类物质,Pb吸收峰证明了白腐真菌对Pb吸附作用;而颗粒中同时出现S吸收峰和Pb吸收峰,因此推测在白腐真菌的吸附过程中,菌丝球的含蛋白质的胞外分泌物会与重金属离子作用,包裹重金属离子,并且粒径不断增大,形成如颗粒A、B所示的Pb-蛋白质球形颗粒物,降低Pb离子对白腐真菌的生物毒性。文献[16,17] 的研究也表明,真菌能够通过胞外聚合物的生物还原等作用,降低低浓度重金属对菌体的生物毒害性。
  与此同时,在研究中,增大铅溶液浓度,发现菌丝球也完成了对铅的部分吸附,但是没有发现显著的生物合成的球形颗粒,如图4所示。因此,判断重金属浓度对生物合成存在显著影响,高浓度的铅抑制了某种生物合成酶的分泌,成而抑制生物合成过程的进行,具体机制和抑制浓度有待进一步研究。


  四、结论


  (1)白腐真菌胞外聚合物与其生长关系密切,单位生物量干重在65h达到最大值。
  (2)白腐真菌胞外聚合物影响菌丝球表面结构和外观形态,进而影响其生物吸附和生物合成过程。
  (3)白腐真菌在吸附低浓度的铅溶液的同时,会在其菌体表面产生微米级的蛋白质-Pb颗粒物,虽然胞外聚合物影响颗粒物形态,但是不影响其元素组成和含量,且颗粒与Ag等已发现的贵金属纳米颗粒存在显著的粒径和组成差异;高浓度的铅对生物合成有抑制作用,抑制浓度和机理有待进一步研究。


  参考文献:
  Alam M Z, Mansor M F, Jalal K C A. Optimization of decolorization of methylene blue by lignin peroxidase enzyme produced from sewage sludge with Phanerocheate chrysosporium[J].Journal of Hazardous Materials,2009,162(2-3):708-715.
  Kim Y, Yeo S, Kim M K, et al. Removal of estrogenic activity from endocrine-disrupting chemicals by purified laccase of Phlebia tremellosa[J]. FEMS Microbiology Letters,2008,284(2):172-175. 
  Yahaya Y A, MatDon M, Bhatia S. Biosorption of copper (II) onto immobilized cells of Pycnoporus sanguineus from aqueous solution: Equilibrium and kinetic studies[J]. Journal of Hazardous Materials,2009,161(1):189-195.
  Das B K, Roy A, Koschorreck M. Occurrence and role of algae and fungi in acid mine drainage environment with special reference to metals and sulfate immobilization[J].Water Research,2009,43(4):883-894.
  ANNA J W, GADD G M. Oxalate production by wood-rotting fungi growing in toxic metal-amended medium [J]. Chemosphere,2003,52(3):541-547.
  MACHUCA A, NAPOLEAO D, MILAGRES AMF. Detection of metalchelating compounds from wood-rotting fungi Trametes versicolor and Wolfiporia cocos[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2001,17(7): 687-690.
  GALHAUP C, HALTRICH D. Enhanced formation of laccase activity by the white-rot fungus Trametes pubescens in the presence of copper[J]. Applied and Microbiological Biotechnology, 2001,56(1/2): 225-232.
  NADANATHANGAM V, KATHE A A, VARADARAJAN P V,et al. Biomimetics of silver nanoparticles by white rot fungus Phaenerochaete chrysosporium[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,2006,53(1):55-59.
  RASHMI S, PREETI V. Biomimetic synthesis and characterisation of protein capped silver nanoparticles[J]. Bioresource Technology,2009,100(1):501-504.
  李越中,高培基.黄孢原毛平革菌合成木素过氧化物酶的营养调控[J].微生物学报,1994,34(1): 29-36.
  Stepanova E V , Koroleva O V , Vasilchenko L G, et al. Fungal decomposition of oat straw during liquid and solid-state fermentation[J]. Applied Biochemistry and Microbiology,2003,39(1):65-74.
  Xu C P, Yun J W. Influence of aeration on the production and the quality of the exopolysaccharides from Paecilomyces tenuipes C240 in a stirred-tank fermenter[J].Enzyme and Microbial Technology,2004,35(1):33-39.
  Ulku Y, Ayla D, et al. THE REMOVAL OF Pb(II) BY PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM[J].Water Research,2000, 34(16):4090-4010.
  Wang Y X, Lu Z X. Optimization of processing parameters for the mycelial growth and extracellular polysaccharide production by Boletus spp. ACCC 50328[J]. Process Biochemistry ,2005, 40(3-4):1043-1051.
  李清彪,吴涓,杨宏泉等.白腐真菌菌丝球形成的物化条件及其对铅的吸附[J].环境科学,1999,20(1):33-38.
  Vigneshwaran N,KATHE A A, VARADARAJAN P V,et al. Silver-protein (core–shell) nanoparticle production using spent mushroom substrate[J]. Langmuir,2007,23(13):7113-7117.
  Chen G Q, ZENG G M, TU X,et al.Application of a by-product of Lentinus edodes to the bioremediation of chromate contaminated water[J]. Journal of Hazardous Materials,2006,B 135(1-3):249-255.
   

 
污染防治与管理更多>>
循环经济与绿色产业发展 更多>>
低碳经济与可持续发展更多>>
中国面临的主要环境问题及对策 更多>>