阿原位乙酰化-顶空固相微萃取测定水中酚类化合物

中国环境学会  2011年 03月30日

  余益军1, *,戴玄吏1,李春玉1,刘红玲2
  1(常州市环境监测中心站,常州 213001)
  2(污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京 210093)


  摘要:建立了原位乙酰化-顶空固相微萃取-气相色谱/质谱联用测定水中酚类氯酚类化合物的方法,考察了对衍生化过程以及萃取过程有影响的相关因素,包括萃取纤维及萃取平衡时间、盐度、衍生化试剂(乙酸酐)与Na2HPO4用量、萃取温度等。结果表明,采用65μmPDMS/DVB萃取纤维效果最好。在10mL溶液中,乙酸酐、Na2HPO4和NaCl用量分别为100μL、0.10g、4.0g,温度在60℃时各被测化合物检出限在0.014~0.044 ng/mL之间,相对标准偏差(RSD)<13.7%,在考察的浓度范围内(0.02~25ng/mL)均呈线性变化。经实际样品测定,完全能满足环境水体中痕量酚类化合物监测的要求。
  关键词:顶空固相微萃取,酚类,衍生化


  1 引  言


  酚类氯酚类物质是广泛使用的化工原料,并导致环境中的广泛存在,其中很多化合物因为其危害被列入中国和美国“水中优先控制污染物”黑名单。目前我国环境监测系统常用挥发酚指标评价酚类污染状况,虽然简单易行,但日益难以满足管理需求,尤其是某些突发性的污染事件,因此快速、准确地定性及定量这些物质对评价污染水平和制定相应的应急措施具有重要意义。
  酚类的经典监测方法为液液萃取,如美国EPA的604方法,以及我国《生活饮用水标准检验方法》等[1-3],这些方法成熟易用,但是耗费大量人力、物力和时间,还大量使用价格高并对健康有害的高纯有机溶剂。固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME) 是集采样、 、浓缩于一体新型样品预处理技术,灵敏度高,操作简单,已经应用于酚类物质的检测分析[4-5],同时我国《生活饮用水标准检验方法》也包涵顶空固相微萃取测定2,4,6-三氯酚和五氯酚[2]。这些SPME萃取酚类都是控制较低pH使其保持分子状态,而酚羟基在色谱柱中的拖尾现象制约了定性定量结果的进一步精确化。
  本文建立了酚类化合物原位乙酰化-顶空固相微萃取-气相色谱/质谱(GC/MS)联用测定水样中的酚类氯酚类化合物的方法,通过考察各种因素的影响变化趋势,获得适宜实验条件。与国标方法相比,该方法将酚羟基乙酰化后再进行富集萃取,降低了化合物的亲水性,大大改善色谱峰型,提高定性和定量的准确度,检出限呈现数量级降低,并且衍生化方法简单易行;由于采用了质谱检测器,可以为化合物结构定性分析提供准确确证。


  2  实验部分


  2.1  仪器与试剂
  Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪 (Agilent Technologies, DE, USA),色谱柱为DB-5MS (30m×0.25 mm, 25μm),5%苯甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱。
  固相微萃取的手柄及五种萃取纤维:PDMS (100μm)、 PA (85μm)、CAR/PDMS (85μm)、PDMS/DVB (65μm),以及DVB/CAR/PDMS(50/30μm)均购自Supelco公司。15 mL顶空萃取瓶, 1cm微型磁子,由WiseStir MSH-20D数码加热磁力搅拌器 (Wisd laboratory Instruments) 控制温度和磁力搅拌。
  苯酚(phenol)、间甲酚(m-Cresol)、2,6-二甲酚(2,6-DMP)、2,4-二甲酚(2,4-DMP)、3,5-二甲酚(3,5-DMP)、2,3-二甲酚(2,3-DMP)、3,4-二甲酚(3,4-DMP)、2-氯酚(2-CP)、4-氯酚(4-CP)、2,4-二氯酚(2,4-DCP)、2,4,6-三氯酚(2,4,6-TCP)等标准溶液由环保部标准样品研究所提供,由甲醇稀释配制成工作溶液,4℃避光保存。色谱纯甲醇购自Tedia。


  2.2  GC/MS条件
  载气:高纯He (99.999%),流速1.0 mL/min;不分流模式进样,进样口温度270℃,吹扫时间2 min,吹扫流速50 mL/min;柱温:初温60℃保持3min,以10℃/min升温至160℃,再以20℃/min升温至260℃, 保持3min。传输线温度为250℃,EI离子源和四级杆温度分别为230℃、150℃,电子能量为70 eV。以选择离子方式定量,定性由保留时间及碎片比例确认完成。


  2.3  实验方法
  在萃取瓶中加入一定量NaCl和Na2HPO4粉末、微型磁转子与10mL样品溶液或实际样品,再加入一定体积乙酸酐,立即用带硅橡胶垫的瓶盖封闭。样品在萃取温度下平衡10min后,将固相微萃取装置的不锈钢针管插入瓶中,推出萃取头进行顶空萃取。萃取完成后,迅速插入气相色谱汽化室内进行热解吸及GC/MS分析。


  3  结果与讨论


  3.1  色谱条件优化
  酚类化合物由于结构中的酚羟基与色谱柱涂层之间的相互作用使得其色谱图存在严重的拖尾现象,而衍生产物显著改善色谱峰型。色谱条件选择以被测组分乙酰化后酯类物质的正己烷溶液进行。衍生化产物制备参考我国国家标准方法[6],即在KHCO3水溶液(10mL)中加入酚类混标溶液使其浓度约为1mg/L、乙酸酐100uL,60℃搅拌反应30min后冷却至室温,加入NaCl(3g),再以正己烷萃取,浓缩备用。经GC/MS确认为各酚类化合物的酯化产物,其分子离子峰含量较低,基峰为酯键断裂后丢失乙酰基(acetyl group)后的结构,主要碎片还有乙酰基(m/z 43),其余碎片与相应酚类的相似。相对于母体化合物,这些乙酰化衍生物保留时间后移,峰型呈对称分布,改善化合物之间的分离度(图1)。

  从质谱破碎特征可见酯键容易破裂,而且分子离子峰含量比率不高,说明这些产物稳定性不高,在高温下可分解。因此设定进样口温度240℃、250℃、260℃和270℃考察温度影响,结果表明260℃响应最大,各化合物变化趋势一致。考虑到较高解析温度有利于降低偏差[7],而270℃下响应与260℃相比相差不多,因此后续操作中均确定进样口温度为270℃。
 
     3.2  萃取纤维选择
  涂渍有聚合物的石英纤维是SPME技术的核心,其纤维涂层类型对萃取效率影响很大;固相微萃取过程是富集平衡的过程,因此涂层厚度对待测物的固相吸附量和平衡时间都有影响。图2为PDMS、PA、CAR/PDMS、PDMS/DVB等纤维涂层在60℃、乙酸酐、Na2HPO4和NaCl用量分别为100μL、0.1g和3.0g、搅拌速率为600rpm时的动力学过程,其中PDMS/DVB平衡时间最短(30min),PDMS居于其中(60min),PA和CAR/PDMS较长(90min),后两者的萃取过程呈现明显的一级动力学特征。
  从分离效果看,PDMA、PA以及PDMS/DVB较好,而CAR/PDMS和DVB/CAR/PDMS两种纤维解析后色谱图拖尾,并造成三对物质未有效分离。因此以峰高比较各种纤维达到基本平衡时萃取效果差异(图3)。PDMS/DVB对所有化合物涂层萃取效果都很好,其次为DVB/CAR/PDMS,PDMS/DVB和DVB/CAR/PDMS两种涂层中有二乙烯苯聚合体,被测物质中也有苯环,因此可能产生苯环之间的π-π作用[8],所以相对于其他纤维萃取效果较好。综合考虑萃取效果、时间和色谱分离,后续操作均采用PDMS/DVB纤维。
     
  3.3  盐度的影响
  盐度对SPME萃取影响较大,一般在溶液中加入氯化钠,通过盐析作用降低某些被测组分在水中的溶解度,从而提高被测组分在涂层中的分配系数。图5是氯化钠的加入量对萃取效率的影响,其余实验条件为PDMS/DVB萃取纤维、乙酸酐100μL、Na2HPO4为0.1g,温度60℃,搅拌速率600rpm。随着盐度增加,盐析效应对萃取效率有很大影响,各种化合物萃取效率都不同程度增加了2.5~10倍,除2,4,6-三氯酚外均在氯化钠过饱和时萃取效率最大。因此选择条件为向溶液中加入氯化钠4g(每10 mL溶液)。
   
  3.4  衍生化试剂(乙酸酐)用量影响
  酚类与乙酸酐在碱性条件下发生取代(乙酰化)反应生成酯类,一般衍生化试剂应过量,由于乙酸酐在碱性条件可发生水解,从而降低溶解碱性,可对衍生化反应造成影响。确定实验条件为PDMS/DVB纤维、NaCl与Na2HPO4分别为4.0g、0.10g、搅拌速率600rpm、60℃萃取30min,考察乙酸酐添加量为50、100、150、200μL时萃取相同浓度酚类的效果差异,结果如图6(A)所示:除苯酚和间甲酚在50μL响应最大外,其余均在100μL除响应最好,呈现非单调变化。因此后续试验中除另有说明外,乙酸酐用量为100μL。
  
  3.5  Na2HPO4用量影响

  我国国家标准方法均采用KHCO3形成碱性环境再进行酚类的乙酰化反应,由于KHCO3与酸产生大量CO2气体,会增大顶空瓶内气体压力,故本实验采用既可产生碱性环境又不会产生气体的Na2HPO4。其用量对萃取效率影响如图6(B),各种酚类均在0.10g与0.15g之间取得最大值。Na2HPO4对萃取效率影响也呈现倒U型非单调变化。
   
  3.6  温度影响

  萃取温度将影响衍生化反应过程,对萃取效率和萃取时间都有一定影响,本文考察了40℃、60℃和75℃三个温度下萃取效率的差异,结果表明苯酚、间甲酚等易挥发酚类随温度升高萃取效率递减,苯酚变化更显著,其他酚类在60℃时取得最大值(图7)。
   
  3.7  重要因素的响应曲面实验设计
  单因子实验设计对于解释因素变化规律很有意义,但其先决条件是因素之间不存在交互作用,而本文中衍生化-顶空萃取很可能存在因素之间的交互作用,因此考察单因素影响的基础上,本文选取乙酸酐(X1)、Na2HPO4(X2)和温度(X3)三个影响呈非单调变化的因素,采用响应曲面实验设计方法-中心复合试验设计法(Central Composite Design)考察交互作用。乙酸酐、Na2HPO4和温度三个因素的高点水平为200μL、0.2g和70℃,低点水平分别为60μL、0.05g和40℃,采用Design Expert 7.1软件进行实验设计和数据分析,通过20次试验,获得萃取效率与三个因素及其交互作用项之间的函数关系,然后获得最优化条件。 
  表1 各被测组分的响应函数与最优化条件

  化合物

响应-因素函数关系

稳健性

最优化条件

F

R2

X1(μL)

X2(g)

X3()

苯酚

Rs=-1.47-0.47X2+0.13X3+0.369X2X3-76.4X22-0.00209X32

14.4

0.837

78

0.09

40

间甲酚

Rs=-9.60+25.2X1+8.57X2+0.344X3+0.360X2X3-0.470X1X3-100.2X22-0.00325X32

17.2

0.909

160

0.13

47

2,6-DMP

Rs=37.6X2+0.180X3-126X22-0.00183X32

8.7

0.700

156

0.15

49

2,4-DMP

Rs=-12.2+26.9X1+29.3X2+0.362X3-0.475X1X3-93.3X22-0.00304X32

9.4

0.813

160

0.16

47

3,5-DMP

Rs=-11.3+25.3X1+13.8X2+0.355X3+0.318X2X3-0.423X1X3-103X22-0.00324X32

9.5

0.848

160

0.15

51.5

2,3-DMP

Rs=-11.1+22.4X1+15.0X2+0.356X3+0.262 X2X3-0.399X1X3-90.8X22-0.00328X32

11.5

0.870

160

0.16

51

3,4-DMP

Rs=-12.0+24.1X1+12.6X2+0.375X3+0.307 X2X3-0.407X1X3-93.3X22-0.00336X32

9.3

0.844

160

0.16

53.5

2-CP

Rs=-7.70+26.0X1+1.20X2+0.284X3+0.454 X2X3-0.536X1X3-96.4X22-0.00280X32

7.9

0.822

60

0.14

56

4-CP

Rs=-11.4+23.5X1+11.4X2+0.376X3+0.360 X2X3-0.431X1X3-110X22-0.00345X32

11.4

0.870

60

0.15

58.5

2,4-DCP

Rs=-8.83+27.6X1-11.7X2+0.272X3-164X1X2 +0.530X2X3-0.685X1X3+161X22-0.00226X32

8.0

0.853

160

0.05

59

2,4,6-TCP

Rs=-1.88+31.3X1-7.53X2-0.0170X3-177X1X2 +0.404X2X3

6.3

0.694

160

0.05

59.5

   表1由后退式多元回归拟合获得的响应-因素函数关系(为便于进行化合物之间比较,对各化合物响应值进行均值中心化处理),同时由软件可以获得各个化合物的最优化条件。从表达式结果可见,交互作用十分明显;对于结构类似的二甲酚同分异构体,各项系数都比较相似。苯酚的响应-因素三维关系如图4所示,由拉格朗日规则求得极值点为X2=0.0918, X3=39.3,这与软件给出的优化点基本一致(表1)。为使每个化合物均取得较好响应,综合考虑设定乙酸酐、Na2HPO4和温度三个因素水平分别为160μL、0.12g和50℃。由于可以通过设定不同化合物的权重从而获得适宜此类化合物的条件,因此在实际应用中可视情况调整试验条件。
   
  3.8 方法线性范围、重复性与检出限
  针对所有化合物,选定测定条件如下:PDMS/DVB涂层纤维,萃取温度60℃,乙酸酐和Na2HPO4分别为100uL和0.10g,NaCl用量为4.0g,样品量为10mL在选定条件下,各化合物的线性范围、相关系数以及重复性如表2所示。与酚类直接以PA涂层萃取相比,该方法检出限低了两个数量级[4]。
  表2 原位乙酰化-顶空固相微萃取测定水中酚类的相关性能参数(浓度单位: ng/mL)

  化合物

线性范围

检出限LOD

重复性b

浓度范围

R2

检出限a

加标浓度

RSD

加标浓度

苯酚 phenol

0.051~6.38

0.992

0.018

0.026

13.7%

0.510

间甲酚 m-Cresol

0.054~6.78

0.990

0.014

0.027

8.54%

0.542

2-氯酚 2-CP

0.050~25.0

0.994

0.029

0.100

11.7%

1.00

4-氯酚 4-CP

0.050~25.0

0.993

0.036

0.100

10.2%

1.00

2,6-二甲酚 2,6-DMP

0.050~25.0

0.995

0.044

0.100

8.22%

1.00

2,4-二甲酚 2,4-DMP

0.050~25.0

0.998

0.040

0.100

10.3%

1.00

3,5-二甲酚 3,5-DMP

0.050~25.0

0.998

0.025

0.100

9.82%

1.00

2,3-二甲酚 2,3-DMP

0.050~25.0

0.998

0.030

0.100

8.91%

1.00

3,4-二甲酚 3,4-DMP

0.050~25.0

0.999

0.039

0.100

9.57%

1.00

2,4-二氯酚 2,4-DCP

0.020~10.0

0.991

0.015

0.043

7.26%

0.799

2,4,6-三氯酚 2,4,6-TCP

0.021~10.7

0.999

0.016

0.026

7.12%

0.858

  a 检出限LOD=S×t(0.99, n-1),n=7
  b  n=6
   
  3.8环境水样的测定
  用该方法分析某厂污水样,预实验表明只含苯酚,故测定条件定为:PDMS/DVB纤维,萃取温度40℃,乙酸酐和Na2HPO4分别为50uL和0.10g,NaCl用量为4.0g,样品量为10mL。为减小批次之间差异,选取邻氯酚为内标(IS),结果表明进出口浓度均值分别为11.0 ng/mL、0.63 ng/mL,GC/MS的选择离子色谱图分别图9所示。进口样品中内标物邻氯酚前有干扰,经谱库检索为萘(m/z=128,与邻氯酚基峰一致),未基线分离,但对积分影响不大。平行试验和加标回收表明相对偏差和回收率分别为9.24%和86.7%,该方法符合质控要求,而且对酚类化合物具有选择性,适于酚类物质的测定分析。

 

  4  结论


  本文建立了水样中酚类物质的原位乙酰化-顶空固相微萃取-气相色谱-质谱方法,水样经SPME萃取后直接进样,无需额外前处理步骤,操作与非衍生化相似,但是灵敏度和选择性显著提高,适用于水体中酚类物质的定量分析。
   
  参考文献
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  [2] GB/T 5750.10-2006, Standard examination methods for drinking water-Disinfection by-products parameters (生活饮用水标准检验方法 消毒副产物指标). National Standards of the People's Republic of China (中华人民共和国国家标准).
  [3] Yang Lili (杨丽莉), Hu Enyu (胡恩宇), Mu Yingfeng (母应锋) , Ji Ying (纪英), Environ. Monitor. in China (中国环境监测) , 2007, 23, 41~44.   
  [4] Zhao Rusong (赵汝松), Liu Renmin (柳仁民),  Cui Qingxin (崔庆新), Chinese J. Anal. Chem. (分析化学), 2002, 30, 1240~1242.
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  [6] GB/T 8972-88, Water quality-Determination of pentachlorophenol-Gas chromatography (水质 五氯酚的测定 气相色谱法). National Standards of the People's Republic of China (中华人民共和国国家标准).
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  [8] Lespes G, Desauziers V, Montigny C and Potin-Gautier M, Journal of Chromatography A 1998, 826, 67~76.
    
  Trace analysis of phenols and chlorophenols in water by in-situ derivatization headspace solid-phase microextraction coupled with GC/MS
  YU Yi-jun*,1, DAI Xuan-li, LI Chun-yu1, LIU Hong-ling 2
  1 (Changzhou Environmental Monitoring Center, Changzhou 213001, China)
  2 (State Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse, School of the Environment, Nanjing University, Nanjing 210093, China)
   
  Abstract: An in situ derivatization headspace solid-phase microextraction method has been developed for the determination of phenols and related chlorophenols in water. Acetylated derivatives are selectively determined using gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). Parameters affecting both derivatization and SPME procedures, such as fiber coating, extraction time, temperature, volume of derivatizating reagent and ionic strength, are studied. The performance of the method is evaluated in terms of accuracy, linearity, precision and limits of detection. Quantitative recoveries and satisfactory precision (RSD ≤13.7%) are obtained. Limits of detection for all target compounds ranged from 0.014 to 0.044 ng/mL. Linearity is studied in a wide range of concentrations. Finally, the applicability of the proposed method is demonstrated for real wastewater samples.
  Keyword: Solid-phase microextraction; headspace; GC/MS; acetylate; phenol
   
  

 
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