STXM技术在大气环境和生物环境监测中的一些应用*

中国环境学会  2011年 03月30日

  杨传俊1,张祥志1,郭智1,娄玉霞2,曹同2,邰仁忠1,包良满1, 张元勋1,李晓林1,李燕1
  1 (中国科学院上海应用物理研究所 上海 201204) 2 (上海师范大学生命与环境科学学院 上海 200234)
   
  为了研究汽车尾气颗粒物的结构和氮的种态以及苔藓细胞监视重金属元素的污染的机理,使用扫描透射X射线显微成像(STXM)技术研究了桑塔纳3000和高尔汽车尾气颗粒物. STXM表明单颗粒物的粒径为500nm,颗粒物质量分布不均匀,有中间空洞. 比较汽车尾气颗粒物和(NH4)2SO4和NaNO3中N的1sX射线近边吸收精细结构谱(NEXAFS),铵盐在406eV有显著的σ*吸收峰,有肩部结构; 汽车尾气颗粒物和NaNO3中N的近边吸收谱在412eV和418.5eV有明显的σ吸收峰; (NH4)2SO4中N的近边吸收谱在413.5eV和421.8eV更宽的σ吸收峰. 硝酸盐是汽车尾气颗粒物中的N种态的主要存在形式. 在395-418eV能量范围内对桑塔纳3000汽车尾气颗粒物进行堆栈扫描,经过主成分分析和聚类分析,发现其表层主要为硝酸盐,内部有少量铵盐. 苔藓细胞在重金属Cr的胁迫下,在叶绿体和细胞壁有明显的富集,并且低浓度胁迫下细胞中的Cr的化学价态还发现了明显的降低, 高浓度胁迫下的细胞损伤更大,富集现象更加突出,但Cr的化学价态没有明显变化.
   
  关键词: 扫描透射X射线显微成像,X射线吸收近边精细结构光谱,透射电镜成像,汽车尾气颗粒物,生物监视器,苔藓
   
  引言


  汽车尾气是大气环境污染的一个主要来源, 它包含的主要有害物质为一氧化碳、碳氢化合物、氮氧化合物、二氧化碳、二氧化硫、碳烟及颗粒物,还有氨、尿素、氰酸盐等一些热解产物[1; 2]. 汽车尾气可以造成很多心肺疾病,尤其对儿童危害更大[3-5]. 国内对汽车尾气颗粒物中挥发性有机物、多环芳烃还有微量金属元素含量和微米结构分布开展了很多研究工作[6-8]. 采用扫描电镜和透射电镜可以看到颗粒物的结构[9; 10]和元素成分,但是很难同时确定不同化学种态在颗粒物内部的分布.
  研究表明,生物监测由于具有简便、真实、灵敏等其他监测手段无法比拟的优越性而备受青昧. 苔藓和地衣植物体形小、结构简单,有着特殊的生理适应机制,分布于各种环境。表面积大,对环境因子反应敏感,是一类很好环境生物指示器,已经广泛应用于对微量元素大气污染的监测[11-19].
  随着第三代同步辐射装置陆续在世界各国的建成,扫描透射X射线显微技术得到了越来越广泛的应用[20]. STXM既可测量高分辨的X射线近边吸收精细结构谱(NEXAFS), 也可以得到空间分辨30~50nm的X射线吸收图像, 能有效地把化学分辨和空间分辨结合在一起, 是研究亚微米尺度下的结构与功能的有力工具. 很多研究人员利用STXM分析机动车尾气颗粒物中碳有机物状态及分布特征[11-15; 21-23]. STXM正越来越广泛应用于环境、生物和材料领域的研究. 本文采用NEXAFS分析了桑塔纳3000和高尔汽车尾气PM2.5颗粒物中氮元素结合状态信息, 运用STXM技术同时确定颗粒物中的氮的种态及其亚微米结构分布特征. 分析了Cr在生物监视器苔藓细胞中的富集特征以及化学种态的变化. STXM技术可以在分子水平和细胞水平上在环境科学研究中发挥重要的作用. 研究苔藓细胞对污染的生理反应机制为进一步阐明苔藓植物监视环境污染的作用机理提供理论依据.


  样品准备和实验
 

  汽车尾气样品采集在上海内燃机研究所的标准实验台架上进行,采样时汽车在标准实验台架上处于全速状态下(5500r·min-1,所用汽油为93# 汽油),用铜管将尾气从排气管引出,接冷凝器、水气分离器后导入一密封箱内,通过已校正的大流量空气采样器(CYQ 26型)收集颗粒物于200mm×250mm玻璃纤维滤膜上.再把颗粒物撒在带有20nm厚碳膜的铜网上,在光学显微镜下观察颗粒物的分布,选择颗粒物离散分布的区域,在照片上加以标记. 对于氮吸收边,选择粒径在1μm左右的颗粒物进行STXM研究.
  小羽藓采自野外,自来水清洗后用蒸馏水、去离子水冲洗三遍. 在25℃和90%湿度的无菌植物培养室内扩繁. 将两代繁殖后的幼体植株置于含有K2Cr2O7的固体培养基中进行金属元素胁迫实验,培养基含有不同浓度的Cr (200mg·L-1(Cr2)与400 mg·L-1(Cr4) ). 然后胁迫30天后对苔藓样品的茎进行包埋,然后进行切片,对照组和Cr2的苔藓茎切片厚度为2μm,Cr4的苔藓茎切片厚度为1.25μm. 把切片铺在铜网进行STXM测量. 还制作了对照组和Cr4苔藓茎70nm的超薄切片用于透射电镜成像.
  本次实验在上海同步辐射装置(SSRF)的软X射线谱学显微线站进行,储存环电子能量3.5GeV,自然水平发射度3.9nm.rad,流强200-300mA. 软X 射线谱学显微光束线站装置见示意图1. 储存环电子经插入件波荡器引出,X射线经过变包含角平面光栅单色器单色化后由波带片聚焦到样品上,然后由快速正比探测器探测透射光子. 光子能量范围:250 ~ 2000eV;能量分辨率(E/ΔE):≥ 2500;空间分辨率:≤ 50nm;光子通量:106 ~ 109 (photons/s). 样品室压强约为10-6托,样品架可以三维移动,还可以绕竖直轴转动. 样品为桑塔纳3000,高尔汽车尾气颗粒物PM2.5,标准参考物质为(NH4)2SO4和NaNO3. 苔藓细胞切片和参考物质K2Cr2O7. 实验流强150-210mA,以0.1eV的步长扫描记录了N的K边和Cr的L边NEXAFS谱.
  
  结果和讨论
 

  桑塔纳3000汽车尾气颗粒物附着在100nm厚的Si3N4薄片,调节样品至聚焦面,使用能量401eV的X射线进行STXM成像. 图2A是步长50nm、扫瞄范围10μm×10μm的颗粒物的STXM图像. 离散的汽车尾气颗粒物粒径500nm左右,呈中空圆形结构。根据图像光通量的大小,发现颗粒物质量分布不均匀,边缘部分质量较高, X射线透过率为75%,中心部分质量偏少,X射线透过率为90%. 此外,还存在团聚在一起呈链状的颗粒物,粒径2μm左右. 为了减小衬底背景干扰,让汽车尾气颗粒物附着在带有20nm厚碳膜的铜网上, 采用30nm步长扫描汽车颗粒物. STXM图2B表明许多小颗粒物团聚在一起构成大的颗粒物,小颗粒物内部分布不均匀,有些部位 X射线透过率为50%,有些部位X射线透过率为90%. 颗粒物表层X射线透过率为90%.  同时由图2C可以看到高尔汽车尾气颗粒物同样也是质量分布不均匀的,中心有些部分X射线透过率为50%,有些部分 X射线透过率为30%. 颗粒物表层X射线透过率为90%.  更精细的结构需要进一步进行三维成像研究,对于N边进行软X射线透射成像,适合研究粒径小于1μm的汽车尾气颗粒物. 选定单个的颗粒物(图2BC中箭头位置所示),测量了桑塔纳3000和高尔汽车尾气颗粒物及参考物质中N的K边近边吸收谱.
   图3为0.1eV能量步长测量的桑塔纳3000和高尔汽车尾气颗粒物和参考物质NaNO3、(NH4)2SO4的N近边吸收谱,还显示了Leinweber等 [24] 测量的KNO3、NH4NO3 (NH4)3PO4近边吸收谱. 由图可见, 所有的N K边近边吸收谱表现出相近的结构特征:在398-403eV能量范围内,有明显的k壳层电子向分子轨道的跃迁1s→ π*;在403-408eV能量范围内,有明显的1s→σ*跃迁;在>408eV能量范围内,有较弱的1s→σ跃迁. NaNO3在401.7eV存在更强的π*吸收峰;(NH4)2SO4在406eV有宽的σ*吸收峰,峰宽是NaNO3的2倍;(NH4)2SO4的σ吸收峰峰宽是NaNO3的1.5倍. 与Leinweber等测量的氮化合物近边吸收谱比较,硝酸盐和铵盐吸收谱在400-410eV能量之间存在较大差异. 铵盐的σ*吸收峰更宽并存在明显的肩部结构;铵盐的σ吸收峰也比硝酸盐的吸收峰宽. 在412eV和418.9eV汽车尾气颗粒物和硝酸盐的吸收谱有明显的σ吸收峰,而在413.5eV和421.8eV铵盐的吸收谱有很弱的σ吸收峰. 汽车尾气颗粒物σ*吸收峰不存在明显的肩部结构. 采用NaNO3和(NH4)2SO4中N的近边吸收谱线性叠加拟合汽车尾气颗粒物的中N的近边吸收谱, NaNO3和(NH4)2SO4对桑塔纳3000汽车尾气颗粒物中N的贡献率分别为70%和28%, 对高尔汽车尾气颗粒物中N的贡献率分别为71%和27%. 本次实验结果和Török等[25] 使用全反射X射线荧光近边吸收谱 (TXRF-NEXAFS) 测量的Si片上的(NH4)2SO4和NaNO3中N的近边谱相似,存在显著的π*吸收峰. 在397eV和399.7eV汽车尾气颗粒物有很小的π*吸收峰,表明颗粒物中含有其它的氮氧化合物和氮有机化合物, 与Leinweber等 [24]、Jeong等[26]测量的氮有机物和NOx 中N的吸收谱有相近的吸收峰. Török等[25]研究布达佩斯城市大气颗粒物,氨根离子和硝酸根离子对氮的K边近边吸收谱贡献率分别为30%和70%,硝酸盐是城市大气颗粒物中氮的主要存在形式, 而汽车尾气是城市大气颗粒物污染一个主要来源. 实验结果表明,汽车尾气颗粒物的N的近边吸收谱与硝酸盐的近边吸收谱有相似的结构特征,硝酸盐的近边吸收谱对汽车尾气颗粒物的近边吸收谱贡献也较大, 因此,硝酸盐为汽车尾气颗粒物主要的氮的存在形态,还有铵盐和其它少量的氮有机物. 由于有机物复杂多样化的结构,还需要研究更多的氮有机化合物标准参考物质的NEXAFS谱.
  对图4右上角中的桑塔纳3000汽车尾气颗粒物,选定2.4μm×2.4μm的范围,以50nm步长、2ms测量时间进行堆栈扫描图像. 在394eV-411eV能量范围内,以0.12eV步长扫描颗粒物;在411eV-418eV能量范围内,以0.2eV步长扫描颗粒物;通过变能量的堆栈扫描,记录了颗粒物不同部分对X射线的吸收结果. 然后对每个点吸收变化进行主成分分析和聚类分析,结果表明主要有5种成分,5种成分的分布图为对图4右下角所示, 它们的吸收谱见图4左侧. 第1、2成分吸收谱相近,对应汽车尾气颗粒物的内部区域,第1成分为颗粒物核心;第5成分对应尾气颗粒物的表层区域;第4成分中间层介于尾气颗粒物内部和表层之间过渡区域;第3成分为外界背景区域. 表层吸收谱和内部吸收谱差异明显,表层在在401.5eV存在明显的的π*吸收峰,在406eV有较明显的σ*吸收峰,表层的吸收谱结构与硝酸盐的吸收谱更接近,体现硝酸盐的特征. 内部有着更宽的σ*吸收峰,存在肩部结构,与铵盐的吸收谱特征相近. 中间层体现过渡特征,硝酸盐和铵盐的吸收谱特征都有体现.
  图5和6分别为苔藓茎对照组和Cr4的透射电镜图像,由图可见,在细胞壁区域富集了一些颗粒,同时叶绿体也发生膨胀并且也富集了一些颗粒. 之前用微区同步X荧光分析技术[18]发现Cr主要分布在苔藓叶片的中肋和边缘处、茎的皮层细胞中. 在高剂量的Cr胁迫下,叶片出现叶绿素降解、失绿、厚度减小等症状. 藓类植物主要由皮层薄壁细胞来运输水分和养料, 所以在皮层细胞也出现了富集. 进一步测量Cr的L边X射线近边吸收精细结构谱,见图7. 对于Cr胁迫下的苔藓细胞都有非常明显近边吸收谱,高浓度的Cr4细胞中吸收谱与参考物质K2Cr2O7.的近边吸收谱相近,然而较低浓度胁迫的Cr2细胞中的Cr化学价态发生了显著的降低. 苔藓细胞自身的免疫机制产生了作用,自我修复使高毒性的Cr6+发生了转变. 图8和9显示了不同浓度胁迫下苔藓细胞在Cr吸收边前后的X射线吸收扫描图像,通过STXM在Cr吸收边和吸收边外成像的比值差异可以看到Cr的富集差异. 低浓度胁迫的Cr2主要在细胞壁和叶绿体区域富集. 高浓度胁迫的Cr4细胞损伤较大,在细胞内部大量富集,细胞壁和叶绿体尤为突出. 由此可见,高浓度胁迫下Cr严重杀伤苔藓细胞,并且破坏了它的免疫机制,使它不能进行自我修复.
   
  结论


  通过STXM分析汽车尾气颗粒物,发现存在很多粒径约500nm的单颗粒物,颗粒物的质量分布不均匀,有的颗粒物中间有空洞,更精细的结构要进一步进行三维CT分析. 汽车尾气颗粒物和NaNO3中N的近边谱在412eV和418.5eV有明显的σ吸收峰,(NH4)2SO4中N的近边谱在413.5eV和421.8eV更宽的σ吸收峰. 硝酸盐是汽车尾气颗粒物中的N化学种态的主要存在形式. 桑塔纳3000汽车尾气颗粒物表层主要为硝酸盐,内部有少量铵盐,还有中间过渡层. 还需要研究更多的标准参考物质来确定汽车尾气颗粒物中复杂多样的有机氮化物, 帮助研究减少氮氧化物排放和改进催化剂设计. 苔藓细胞在重金属Cr的胁迫下,在叶绿体和细胞壁有明显的富集,并且低浓度胁迫下Cr的化学价态还发生了明显的变化. 观测到苔藓细胞结构的变化和对污染的生理反应特征. 苔藓细胞的自身免疫机制和生理反应机理可以进一步研究探讨. 运用STXM技术可以在细胞水平和分子水平揭示苔藓生物监视环境污染机理发挥其他检测技术不可替代的重要作用.
   
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  *中国科学院知识创新工程重要方向性项目(批准号:KJCX2-YW-N38)和上海市基础研究重点项目(批准号:08JC1422600)资助的课题
  第一作者,杨传俊,硕士,中科院上海应用物理研究所博士研究生,E-mail: yangchuanjun@126.com
  通讯联系人,电话:021-33933187,E-mail: tairenzhong@sinap.ac.cn

 
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