GFP标记对广谱拮抗菌B96-II的影响[1]

中国环境学会  2011年 03月30日

  郝变青,马利平,乔雄梧,  (山西省农业科学院  山西省农药重点实验室,0351-7965396,太原 030031)
   
  摘要:本文研究了绿色荧光蛋白标记对广谱拮抗菌B96-II的生长及拮抗功能的影响。结果表明:绿色荧光蛋白标记对菌株的抑菌活性没有影响,对12种植物病原菌仍表现出高效广谱抑菌活性;标记对菌株的生长略有影响,标记后的菌株最大生物量减少了19.3%,最大比生长速率降低了5.1%,代时延长了5.8%。
  关键词:绿色荧光蛋白  拮抗菌  生物防治


  生物、微生物农药对于防治植物病害具有安全、持久的效果,在“食品安全和质量安全”呼声越来越高的今天,研究开发微生物农药显得十分必要。B96-II是本室从沤肥浸渍液中分离筛选到的一株对多种土传病害具有良好防治效果的拮抗菌[1]。但由于微生物个体微小,新的拮抗菌施入环境后,用传统的方法不易将其与同类的土著微生物区分开,从而不易对其土壤和环境行为进行直观、快速、高效的检测,对靶标的作用以及一系列的行为动态研究成为盲区。为此,抗生素标记成为人们常用的手段,然而这种方法却不易区别环境中对标记抗生素有同样抗性的土著微生物。标记基因技术的建立与发展,为细菌定殖的微生态学研究提供了有效手段。LacZ、gus、xylE以及lux等标记基因已被广泛应用于微生物的环境示踪[2,3]。其中绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记系统由于荧光性能稳定、检测方便、灵敏度高且表达不受种属限制等特性,而越来越为人们重视,并被成功地用于研究细菌在植物根部的定殖[4]及工程菌向环境的释放[5]。本文研究了绿色荧光蛋白标记对广谱拮抗菌B96-II的生长及拮抗功能的影响。


  1 材料与方法
 

  1.1 材料
  1.1.1菌株
  拮抗菌B96-II为本研究室从沤肥浸渍液中分离筛选得到
  1.1.2 主要试剂与仪器
  LB培养基;氯霉素(Cm);荧光显微镜(OLYMPUS BX51);高速冷冻离心机(sigma 3K15)等。


  1.2 GFP标记对菌株抑菌活性的影响
  划线接种B96-II和B96-II-gfp于 PDA平板两侧,37℃培养,48h后在平板中央接种病原菌菌饼,以不接拮抗菌的平板为对照,28℃培养,共培养7d后测量病原菌的半径,分别计算标记菌株和出发菌株对病原菌的抑制率。

  

  1.3 GFP标记对菌株生长的影响
  B96-II和B96-II-gfp分别经活化后在LB平板(后者需加入氯霉素)上划线培养,然后选取单菌落接种到LB液体培养基(后者需加入氯霉素)中,37℃下150rpm培养过夜。各取5mL菌液用新鲜的LB培养基洗涤菌体3次以除去抗生素和菌体代谢物,之后将菌体悬浮在5mL相同的培养基中,比色测定两菌的A600nm值。其中洗涤过的B96-II悬浮菌液按1%(V/V)的接种量接种到无抗生素的LB培养基中,而B96-II-gfp在接种到无抗生素的LB培养基时,则根据洗涤过的种子液的浊度值对接种体积加以调整,使接菌量的绝对值与B96-II的接种量相当。两菌的培养条件完全相同,150mL三角瓶装液量50mL, 37℃下200rpm振荡培养,定时取样并测定菌体A600nm值。
   
  2 结果与分析


  2.1 GFP标记对菌株B96-II抑菌活性的影响结果
  室内平板抑菌试验结果表明,标记菌株B96-II-gfp与出发菌株B96-II抑菌活性无显著差异,对以枯萎菌(Fusarium oxysporum Schl)为主的12种植物病原真菌有较强的抑制作用(表1)。
  表1  B96-II和 B96-II-gfp对病原菌的抑菌活性
  Table 1  The antifungal activities of B96-II and B96-II-gfp

  供试菌

Fungi

菌落半径(mmColony semidiameter

 

抑制率(%Inhibition

CK

B96-II

B96-II-gfp

B96-II

B96-II-gfp

黄瓜枯萎菌

F. o. f. sp. cucumerinum

43.3+1.0a

10.4+0.6b

10.3+0.4b

 

82.3

82.5

西瓜枯萎菌

F. o. f. sp. niveum

42.4+1.1a

15.3+1.8b

16.4+2.2b

 

69.3

66.5

青椒枯萎菌

F. o. f.sp.Vasinfectum

42.3+1.1a

9.4+2.1b

9.0+2.9b

 

84.6

85.6

一品红枯萎菌

F. o. f. sp

42.4+0.8a

16.1+0.9b

16.5+1.0b

 

66.9

65.9

仙客来枯萎菌

F. o. f. sp

42.5+0.6a

16.0+0.3b

16.3+0.6b

 

67.6

66.8

番茄枯萎菌

F. o. f. sp. lycopersici

26.1+7.8a

7.1+1.3b

6.4+1.3b

 

83.3

86.4

棉花枯萎菌

F. o. f.sp.Vasinfectum

43.0+1.3a

10.9+0.9b

10.6+0.6b

 

80.9

81.6

芦笋枯萎菌

F. o. f. sp. Asparagi

39.9+4.3a

19.6+1.0b

19.4+0.5b

 

55.5

56.0

芦笋茎枯菌

Phomopsis asparagi

43.6+0.8a

16.1+1.2b

16.4+0.4b

 

68.2

67.5

青椒疫病菌

Phytophthora capsici

42.7+1.4a

12.5+0.6b

12.5+1.0b

 

76.6

76.6

番茄早疫病菌

Alternaria solani

34.3+0.8a

9.6+1.2b

10.0+0.6b

 

79.7

78.4

番茄晚疫病菌

Phytophthora infestans

43.0+0.9a

8.9+0.8b

9.4+0.7b

 

85.9

84.6

  注:表中数字均为7次重复的平均值,同行数据后小写字母不同者表示在0.05水平时差异显著。
  Note: The date are the average of seven replicates. The different letters in the same row show the significant difference at 0.05 level.


  2.2 GFP标记对菌株生长的影响
  试验表明:B96-II和B96-II-gfp-13在LB液体培养基,生长曲线的变化趋势基本相同。B96-II-gfp生长的最大A600nm为0.969,B96-II生长的最大A600nm为1.200,标记菌株的最大生物量低于出发菌株约19.3%;为了比较两者生长速度的差异,将B96-II和B96-II-gfp的生长配以Logistic曲线积分式,作图并进行回归分析。B96-II线性方程为y=-0.8037x+3.2296,R2=0.9459,B96-II-gfp线性方程为y=-0.7624x+3.1969,R2=0.9677,这里拟合方程的相关系数R2很高,相关性很好。根据拟合方程可知,B96-II和B96-II-gfp在LB培养基中的最大比生长速率μmax分别为0.8037h-1和0.7624h-1,标记菌株的最大比生长速率减少了5.1%。如果设代时为T,则根据T=ln2/μmax,可计算出B96-II和B96-II-gfp的代时分别为0.86h和0.91h,标记菌株代时延长了5.8%。
   
  3 讨论
 

  野生型芽孢杆菌由于存在复杂的遗传修饰系统,遗传转化效率低,甚至不能转化[7]。本实验室通过鸟枪法构建了广谱拮抗菌B96-II的启动子基因文库,其中有4个大小不同的穿梭表达载体成功转入拮抗菌B96-II,实现了GFP在B96-II-gfp中的良好表达[8,9]。
  然而微生物在外源基因标记后,研究外源基因作为一种负载对标记微生物生长的影响是极为重要的[10]。GFP标记是否会影响菌株的生物量和生长速率,标记后的菌株是否依然保持出发菌株的高效广谱抑菌活性,这些都是标记菌株在实际应用前必须了解的。GFP标记菌株对12种病原真菌的抑菌活性与出发菌株相比,经统计分析无显著性差异,可推测绿色荧光蛋白标记不会影响拮抗菌的抑菌活性物质的种类组成及含量;GFP标记对B96-II的生长略有影响,可能是由于标记菌株中GFP的大量表达,增加了宿主菌的营养负荷,结果使得标记菌与出发菌相比,最大生长速率降低,代时延长。
  以上研究表明绿色荧光蛋白标记对B96-II的生长及抑菌活性影响小,标记后的菌株可用于检测拮抗菌在土壤、植株中定殖规律及防病机理的进一步研究。


  参考文献(References)
  1 郝变青,马利平,乔雄梧,等. 拮抗菌对黄瓜枯萎病菌的室内生物活性[J]. 应用与环境生物学报,2001,7(2):155-157.
  2 陈晓斌,张炳欣,楼兵干,等. 应用生色基因标记黄瓜根围促生菌(PGPR)筛选菌株[J]. 微生物学报,2001,41(3):287-292.
  3 Xi C W, Lambrecht M, Vanderleyden J , et al. Bi-functional gfp-and gusA-containingmini-Tn5 transposon derivatives for combined gene expression and bacterial localization studies[J]. Microbiol Meth, 1999, 35:85-92.
  4 Ramos H J O, Roncato-Maccari L D B, Souza, et al. Monitoring Azospirillum-wheat interaction using the gfp and gusA genes constitutively expressed from a new broad-host range vector[J].  Biotechnol, 2002, 97:243-252.
  5 Scott K P, Mercer D K, Glover L A, et al. The green fluorescent protein as a visible marker for lactic acid bacteria in complex ecosystems[J]. Fems Microbiol Ecol,1998,26:219-230.
  6 诸葛健. 现代发酵微生物实验技术[M]. 北京:化学工业出版社,2005.
  7 陈中义,张杰,曹景萍,等. 杀虫防病遗传工程枯草芽孢杆菌的构建[J]. 生物工程学报,1999,15(2):215-220.
  8 郝变青,马利平,乔雄梧,等. 广谱拮抗菌B96-II启动子的克隆研究[J]. 安徽农业科学,2009,37(16):7387-7388,7395.
  9郝变青,马利平,乔雄梧. 广谱拮抗菌B96-II的分子鉴定及GFP标记[J]. 华北农学报,2009,24(5):188-191.
  10 Tomblini R, Unge A, Davey M E, et al. Flow cytometric and microscopic analysis of GFP-tagged Pseudomonas fluorescens bacteria[J]. Fems Microbiol Ecol, 1997, 17:21-28.
  
  基金项目:山西省青年基金项目(2007021037),山西省重点实验室开放基金项目(200603021)和山西省留学人员项目(2006年82号)
  通讯作者: 乔雄梧,研究员,博士,主要从事农药残留分析和微生物农药的研究;E-mail:XWQIAO@PUBLIC.TY.SX.CN
  作者简介: 郝变青(1975 - ),女,山西原平人,助理研究员,在读博士,主要从事植物病害生物防治研究,E-mail:haobianqing@163.com
   

 
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